Cтраница 2
По предложению Бейли, в формулах линейных пептидов аминокислота со свободной аминогруппой называется - концевой аминокислотой, в горизонтально изображенной пептидной цепи она стоит слева. Аминокислота со свободной карбоксильной группой обозначается как С-концевая аминокислота. В соответствии с этим в приведенном выше примере аланин - N-концевая, а глицин - С-концевая аминокислота. Фромажо предложил остаток, несущий сободную а-аминогруппу, называть начальной аминокислотой, а соответствующий остаток со свободной карбоксильной группой - конечной аминокислотой. Хотя это предложение кажется более простым, широкое признание получила рекомендация Бейли. [16]
Затем аминокислоты отделяют друг от друга хрома-тографическим методом ( рис, 14.3) и идентифицируют концевую аминокислоту с присоединенной к ней окрашенной группой. Белок можно частично гидролизовать до пептидов, в каждом из которых будет содержаться несколько аминокислотных остатков. Эти пептиды затем выделяют хроматографическим методом и определяют последовательность расположения в них аминокислот. [17]
Несколькими годами позже Завгер [9, 10], применив метод ДНФБ, подтвердил, что фенилаланин является концевой аминокислотой одной ив полипептидных цепей инсулина. [18]
Пауэре ( личное сообщение) установил, что гемоглобины без эффекта Бора отличаются от обычных концевыми аминокислотами ос - и Р - цепей. Известно, что у млекопитающих за эффект Бора ответственны главным образом С-концевые остатки гистидина в р-цепях и свободные N-концевые аминогруппы а-це-пей. В одном гемоглобине рыб, не обнаруживающем эффекта Бора, С-концевой аминокислотой Р - цепей оказался не гистидин и, кроме того, N-концевые группы - цепей были блокированы. [19]
Наоборот, Хорнуфф и Флат [98], проводя опыты с триазино-выми красителями, определили, что другая концевая аминокислота - валин т - вступает с ними в реакцию, а аспарагиновая и глутамйновая кислоты - нет. Они обнаружили, что в-боковых цепях реагируют аргинин и гистиднн, но не лизин. Хилле [105] считает активными центрами, в боковых цепях гистидин, серии и цистеин, а Дербишир и Тристрам [108], работавшие с акриламидными красителями, что в реакцию вступает только свободная аминогруппа связанного лизина. [20]
Под действием протеолитических ферментов ( протеиназ) белки расщепляются на строго определенные фрагменты, называемые пептидами, с концевыми аминокислотами, соответствующими избирательности действия протеиназ. Структура некоторых таких фрагментов неполного гидролиза доказана последующим химическим их синтезом. [21]
Динитрофторбензол ( 86; X F) из-за его высокой реакционной способности часто используют для связывания МН2 - группы концевой аминокислоты при анализе концевых групп белка. Присоединившуюся при этом 2 4-динитрофенильную группу очень трудно отщепить; она сохраняется даже при последующем гидролизе белка на составляющие его аминокислоты. [22]
Состав этих пептидов и тот факт, что при частичном гидролизе пептида В4 образуются меньшие пептиды В2 и В3, позволяют установить, начиная от концевой аминокислоты, следующую аминокислотную последовательность: фенилаланин - валин - аспарагиновая кислота - глутаминовая кислота. [23]
Метод Эдмана последовательной деградации пептидов и белков основан на реакции фенилизотиоцианата с концевой аминогруппой в щелочной среде, которая приводит сначала к образованию тиомочевинной метки концевой аминокислоты, последняя при действии CF3COOH отщепляется, в конечном счете, в виде замещенного фенилтиогидантоина, после чего полипептидная цепь белка укорачивается на один аминокислотный остаток. [24]
Почти во всех случаях остаток изолейцина заменен на остаток лейцина, а в случаях ( 6) и ( 7) в молекулу пептида вместо лейцина введен лизин. Концевыми аминокислотами всегда являлись аминокислоты с ароматическими боковыми цепями; только у пептидов ( 8) и ( 9) С-концевой фенилаланин заменен на тирозин. [25]
Эта реакция протекает па холоду в слабо щелочной среде ( NallCO. ДИФ-производпое) концевой аминокислоты, которое является более стойким к гидролизу, нежели пептидные связи между алнпюкпслотамп. [26]
При применении ДНФБ-метода белок с присоединенным остатком ДНФБ подвергают мягкому гидролизу, а в гидролизате путем хроматографирования определяют аминокислоту, к которой присоединен остаток ДНФБ. Такой аминокислотой может быть концевая аминокислота или лизин. [27]
На следующем этапе отщепляют новую концевую аминокислоту и снова определяют N-конец остатка. [28]
Свободные аминогруппы, которые содержатся только на N-кон-цах белковых цепей и в остатках лизина ( е-аминогруппа), обнаруживают, добавляя к белку фенилизотиоцианат ( ФТЦ-метод) или динитрофторбензол ( ДНФБ-метод. При добавлении к белку фенил-изотиоцианата образуются фенилтиогидантоиновое производное концевой аминокислоты и укороченный пептид с новой концевой аминогруппой. С помощью хроматографии на бумаге идентифицируют фенилтиогидантоиновое производное, а оставшийся пептид снова обрабатывают фенилизотиоцианатом. Таким образом можно определить последовательность до десяти аминокислот; дальнейшее определение аминокислот затрудняется увеличением количества побочных продуктов. [29]
Ион Ф41 теряет затем молекулу СО, образуя альдимин-ный фрагмент Ф42, характерный для масс-спектров аминокислот. Последний элиминирует молекулу альдимина, образуя новый ацилиевый фрагмент Ф41, содержащий на одну концевую аминокислоту меньше, чем в исходном полипептиде. Такой процесс распада продолжается до тех пор, пока не будут отстрижены все аминокислотные остатки. [30]