Cтраница 3
Кальцитонин человека содержит дисульфидный мостик ( между 1 - м и 7 - м аминокислотными остатками) и характеризуется N-концевым цистеином и С-концевым пролинамидом. Кальцитонины быка, овцы, свиньи и лососевых рыб мало отличаются друг от друга как по структуре и концевым аминокислотам, так и по гипокальциемической активности. Биологическое действие кальцитонина прямо противоположно эффекту паратгормона: он вызывает подавление в костной ткани резорбтивных процессов и соответственно гипокальциемию и гипофосфатемию. Это следует учитывать при хирургических лечебных манипуляциях на данных железах. [31]
Анализ концевых групп является классическим методом химии белков, в котором N - и С-концевые аминокислоты каждой полипептидной цепи определяются с помощью специфических реагентов или ферментативным гидролизом. Во многих случаях бывает трудно рассчитать число полипептидных цепей на основе анализа концевых групп только потому, что выход концевой аминокислоты после ферментативного гидролиза или химической реакции иногда оказывается очень низким. Другая трудность при идентификации полипептидных цепей с помощью анализа концевых групп заключается в том, что аминогруппа N-концевой аминокислоты может быть заблокирована ацетильной группой. [32]
В отличие от определения N-концевых групп в пептидных цепочках, для которого мы располагаем удобными и широко распространенными химическими методами идентификации, например динитрофенилирование или реакция с фенилизотиоцианатом, для работы с С-конневыми аминокислотами в пептидах и белках лучше всего зарекомендовал себя ферментативный ( карбоксипептидазный) метод, который имеет, однако, некоторые ограничения. Этот метод нельзя, например, применять для нерастворимых белков ( кератин и фиброин), и, кроме того, па течение реакции наряду с концевой аминокислотой оказывает влияние также предпоследняя аминокислота. Из химических методов для определения карбоксильных групп был разработан тиогидантоиновый метод, который дает относительно низкие выходы, и, кроме того, метод восстановления, сведения о котором, встречающиеся в литературе, весьма противоречивы. Нам кажется, что довольно хорошим методом, дополняющим результаты, полученные карбоксипептидазным методом, будет гидразинолиз, совместно с доказательством и определением С-концевой аминокислоты в виде динитрофенил-нроизводного. Остальные методы, приведенные в табл. 84, применяются довольно редко. [33]
Считается, что процесс удлинения цепи включает участие остатка фосфопантетеина, который был обнаружен в системе тяжелого фермента. Полагают, что пантетеин работает как тиольный донор типа размахивающей руки, принимая и подавая растущую пептидную цепь то к участку, где аминокислота присоединяется путем транстиолирования, то от этого участка до тех пор, пока не присоединится остаток концевой аминокислоты. [34]
Химотрипсин в щелочной среде ( рН 8) гидролизует в пептидах преимущественно связи тех же ароматических кислот, что и пепсин, но с другой стороны - со стороны карбоксила. Трипсин рвет пептидные связи со стороны карбоксила у остатков лизина и аргинина. Кирбокси-пептидазы осуществляют гидролиз концевой аминокислоты, имеющей свободный карбоксил. С аминного конца белка или пептида подобный гидролиз осуществляют аминопептидазы. Они входят в состав ферментного выделения стенок тонких кишок. Здесь пищеварение заканчивается полным гидролизом до аминокислот в результате действия на дипептиды фермента дипептидазы. Аминокислоты всасываются через стенки кишечника и поступают в кровь. [35]
Строение ферментов и их биологическое действие ниже рассмотрено на примере карбокси-пептидазы А. Этот фермент поджелудочной железы млекопитающих отщепляет концевую аминокислоту от белковой цепи при гидролизе, обычно это фенилаланин. [36]
Обсудим последовательные стадии определения первичной структуры небольшого пептида; для белка эта процедура аналогична, но более громоздка. Сначала необходимо выяснить, какие аминокислоты находятся на концах цепи. Обратите внимание, что на рис. 40.1 одна концевая аминокислота содержит свободную а-аминогруппу, а другая концевая аминокислота - свободную сс-карбоксильную группу. Эти аминокислотные остатки называют соответственно N-концевым и С-концевым. В соответствии с методикой, разработанной Сенджером в его работе с инсулином, сначала используется 1-фтор - 2 4-динитробензол, который образует стабильное динитрофенильное производное с N-концевым остатком. После кислотного гидролиза модифицированная аминокислота отделяется и идентифицируется. Определение С-концевого остатка можно провести с помощью осторожной обработки ферментом карбоксипептидазой, которая специфически катализирует гидролиз С-концевой пептидной связи, отщепляя от полнпептидной цепи единственную аминокислоту. Существуют также и другие методы определения N - и С-конце-вых аминокислотных остатков, но два описанных являются наиболее распространенными. [37]
Обсудим последовательные стадии определения первичной структуры небольшого пептида; для белка эта процедура аналогична, но более громоздка. Сначала необходимо выяснить, какие аминокислоты находятся на концах цепи. Обратите внимание, что на рис. 40.1 одна концевая аминокислота содержит свободную а-аминогруппу, а другая концевая аминокислота - свободную а-карбоксильную группу. Эти аминокислотные остатки называют соответственно N-концевым и С-концевым. В соответствии с методикой, разработанной Сенджером в его работе с инсулином, сначала используется 1-фтор - 2 4-динитробензол, который образует стабильное динитрофенильное производное с N-концевым остатком. После кислотного гидролиза модифицированная аминокислота отделяется и идентифицируется. Определение С-концевого остатка можно провести с помощью осторожной обработки ферментом карбоксипептидазой, которая специфически катализирует гидролиз С-концевой пептидной связи, отщепляя от полипептидной цепи единственную аминокислоту. Существуют также и другие методы определения N - и С-конце-вых аминокислотных остатков, но два описанных являются наиболее распространенными. [38]
Действуя на у-гл булин кристаллическим папаином в присутствии цистеина, Портер 202 расщепил макромолекулу на три фрагмента, не считая небольшого количества низкомолекулярных осколков. Фрагменты А, В и С представляют собой белки и разделяются хроматографически на целлюлозных ионитах. Фрагменты А и С имеют молекулярный вес 50 000; концевая аминокислота со стороны NH2 - Konu a в них - аланин. Аминокислотный состав этих белков столь сходен, что можно полагать их одинаковыми. [39]
При анализе аланилметионина ( Тернер и Шмерцлер) был получен однозначный результат только при гидролизе соответствующего тиогидантоина гидроокисью бария; при гидролизе бромистоводородной кислотой вместо одного пятна метионина получалось несколько пятен. К подобному же результату приводил анализ лейцилпролилглицина, где в качестве концевой аминокислоты открывали лишь гликокол; пролин не дает тиогидантоина. Точно так же нельзя определить тиогидантоиновым методом концевую аминокислоту в случае аспарагиновой и глутаминовой кислот, лизина и аргинина. [40]
Эта метка является хромофорной группой благодаря наличию в ней протяженной системы сопряженных связей, поэтому аминокислота, несущая метку, становится окрашенной в отличие от остальных аминокислот. При последующем гидролизе меченого пептида аминная связь 2 4-динитрофенильной группы с пептидом не затрагивается, и в образовавшейся смеси аминокислот только N-концевая кислота оказывается меченой. Анализ гидролизата с помощью тонкослойной хроматографии позволяет однозначно идентифицировать N - концевую аминокислоту путем сравнения хроматографической подвижности окрашенного пятна из гидролизата с подвижностями заведомых 2 4 - ДНФ-производных аминокислот. [41]
В этом методе используется кристаллический а-ацетил-р-этокси - К-карбэтоксиакриламид II, получаемый присоединением уретана к дикетену с последующей реакцией образовавшегося N-ацетоацетилуретана I с ортомуравьиным эфиром и уксусным ангидридом. Реагент II в слабощелочном водном растворе быстро реагирует с пептидом, при этом образуется соответствующее 5-ацетилурацильное производное III. При последующем кислотном гидролизе получается смесь аминокислот и замещенный урацил IV из концевой аминокислоты. [42]
В этом методе используется кристаллический а-ацетил-р-этокси - М - карбэтоксиакриламид II, получаемый присоединением уретана к дикетену с последующей реакцией образовавшегося М - ацетоацетилуретана I с ортомуравьиным эфиром и уксусным ангидридом. Реагент II в слабощелочном водном растворе быстро реагирует с пептидом, при этом образуется соответствующее 5-ацетилурацильное производное III. При последующем кислотном гидролизе получается смесь аминокислот и замещенный урацил IV из концевой аминокислоты. [43]
Обсудим последовательные стадии определения первичной структуры небольшого пептида; для белка эта процедура аналогична, но более громоздка. Сначала необходимо выяснить, какие аминокислоты находятся на концах цепи. Обратите внимание, что на рис. 40.1 одна концевая аминокислота содержит свободную а-аминогруппу, а другая концевая аминокислота - свободную сс-карбоксильную группу. Эти аминокислотные остатки называют соответственно N-концевым и С-концевым. В соответствии с методикой, разработанной Сенджером в его работе с инсулином, сначала используется 1-фтор - 2 4-динитробензол, который образует стабильное динитрофенильное производное с N-концевым остатком. После кислотного гидролиза модифицированная аминокислота отделяется и идентифицируется. Определение С-концевого остатка можно провести с помощью осторожной обработки ферментом карбоксипептидазой, которая специфически катализирует гидролиз С-концевой пептидной связи, отщепляя от полнпептидной цепи единственную аминокислоту. Существуют также и другие методы определения N - и С-конце-вых аминокислотных остатков, но два описанных являются наиболее распространенными. [44]
Обсудим последовательные стадии определения первичной структуры небольшого пептида; для белка эта процедура аналогична, но более громоздка. Сначала необходимо выяснить, какие аминокислоты находятся на концах цепи. Обратите внимание, что на рис. 40.1 одна концевая аминокислота содержит свободную а-аминогруппу, а другая концевая аминокислота - свободную а-карбоксильную группу. Эти аминокислотные остатки называют соответственно N-концевым и С-концевым. В соответствии с методикой, разработанной Сенджером в его работе с инсулином, сначала используется 1-фтор - 2 4-динитробензол, который образует стабильное динитрофенильное производное с N-концевым остатком. После кислотного гидролиза модифицированная аминокислота отделяется и идентифицируется. Определение С-концевого остатка можно провести с помощью осторожной обработки ферментом карбоксипептидазой, которая специфически катализирует гидролиз С-концевой пептидной связи, отщепляя от полипептидной цепи единственную аминокислоту. Существуют также и другие методы определения N - и С-конце-вых аминокислотных остатков, но два описанных являются наиболее распространенными. [45]