Cтраница 3
Первая стадия реакции представляет собой ацилирование активного центра, приводящее к образованию стабильного и не-реакционноспособного ацилфермента, при этом ацильная группа блокирует активный центр. [31]
Не так давно был поставлен вопрос, протекает ли катализируемый химотрипсином гидролиз амидов через промежуточный ацилфермент или же молекула амида, сорбированная на активном центре фермента, подвергается прямой атаке водой или другим акцептором. [32]
Для того чтобы решить вопрос о внутренней реакционной способности ферментного нуклеофила, действующего в ацилферменте, сравним скорость этой псевдовнутримолекулярной реакции с аналогичной межмолекулярной реакцией. Атакующая группа составного нуклеофила - это молекула воды, эффективная концентрация которой в псевдовнутримолекулярных реакциях вряд ли может превысить, как полагает Дженкс [10], значение 55М, даже если учитывать некоторую степень ориентации молекулы воды при связывании ее в систему с переносом заряда ( см. § 3 в гл. [33]
На схеме ( 28) представлен алкоголиз амида, катализируемый общим основанием; последующий гидролиз ацилфермента является катализируемым общим основанием гидролизом сложного эфира. Последняя реакция нам уже знакома: это обычный механизм гидролиза сложных эфиров с плохими уходящими группами. Примером, наиболее соответствующим гидролизу ацилхимо-трипсина, является гидролиз УУ. [34]
Для более глубокого понимания механизма действия активного центра интересно сравнить абсолютное значение стандартной свободной энергии образования ацилфермента ( в отсутствие гидрофобного субстратного фрагмента R) с аналогичной характеристикой какой-либо модельной ( неферментативной) реакции. [35]
Сравнение двух серий субстратов показывает, что а-ацетамидная группа вносит практически постоянный вклад в понижение свободной энергии активации гидролиза ацилферментов независимо от структуры боковой группы ацилфермента. [36]
Химотрипсин является одним из наиболее изученных ферментов, для которого в деталях расшифрован механизм ферментативного катализа, включающий образование промежуточного продукта ацилфермента. Доказана существенность для катализа гидроксильной группы серина и непротонированного остатка гистидина в активном центре фермента. [37]
Кроме того, константа щелочного гидролиза О-циннамонл - М - ацетилтпрозинамида в 7 74 AJ мочевине совпадает с соответствующей константой для ацилфермента. Таким образом, поведение циннамоилфермента в растворе мочевины совершенно отлично от поведения ацилимидазола, но очень близко к поведению эфиров серина или тирозина. [38]
Превращение этого ключевого остатка серина в остаток дегидроалани-на полностью инактивирует химотрипсин, что указывает на необходимость образования в качестве промежуточного продукта ацилфермента с ацилиро-ванием по данной гидроксильной группе серина. [39]
Катализ сериновыми протеазами включает стадию, катализируемую общим основанием, роль которого выполняет имидазолильная группировка остатка гистидина, поэтому соединение 10.14 можно рассматривать как модель ацилфермента. [40]
Сравнение двух серий субстратов показывает, что а-ацетамидная группа вносит практически постоянный вклад в понижение свободной энергии активации гидролиза ацилферментов независимо от структуры боковой группы ацилфермента. [41]
На рисунке 26 приведены данные работы Спенсера и Стэрте-ванта ( Spencer, Sturtevant, 1959), которые однозначно свидетельствуют в пользу кинетической схемы (4.10), где ацилфермент выступает в качестве промежуточного соединения в механизме реакции. [42]
Проведенное рассмотрение показывает, что даже такой плохо реагирующий субстрат, каким является карбоксилат-ион, может реагировать с ферментом в виде более реакционной свободной кислоты, образуя ацилфермент. Гораздо большие спектральные изменения при ацилировании и деацилировании обнаруживают менее специфические субстраты типа производных цинна-моила, фуроила или бензоила, которые также реагируют с химотрипсином, образуя ацилфермент. [43]
В итоге приходим к выводу, что конформационно-сольватационные изменения в активном центре, осуществляющиеся при ( и за счет) сорбции субстрата на ферменте, приближают комплекс Михаэлиса ( или, соответственно, ацилфермент) к переходному состоянию химической стадии ( см. гл. Не исключено, что именно при этом происходит тонкая настройка по отношению друг к другу функциональных групп белка, входящих в составной нуклео-фил активного центра. [44]
Второй же вывод ( о необходимости более высокой реакционной способности серосодержащих акцепторов по сравнению с кислородосодержащими в случае ковалентного гликозилфермента) слишком категоричен, так как, по всей видимости, ни разу не был экспериментально подтвержден в ферментативных реакциях с использованием гликозил - или ацилферментов. [45]