Cтраница 4
Одно из серьезных ограничений гель-электрофореза как метода выделения специфических фрагментов ДНК заключается в том, что молекулы, имеющие примерно одинаковую массу, но различную нуклеотидную последовательность, обладают, как правило, одинаковой электрофоретической подвижностью. Один из возможных подходов к решению этой проблемы основан на использовании предложенного в работе Фишера и Лермана [115] метода двумерного гель-электрофореза фрагментов ДНК. Разделение проводят при повышенной температуре. В этой методике использован эффект резкого уменьшения электрофоретической подвижности в результате денатурации или плавления части нативной молекулы ДНК. В ходе электрофореза во втором направлении фрагменты ДНК подвергаются воздействию все более жестких денатурирующих условий, и плавление части молекулы двухцепочечной ДНК сопровождается скачкообразным изменением ее подвижности. [46]
Медленное достижение конечного значения поверхностного натяжения таких растворов происходит отнюдь не от медленной скорости диффузии молекул белка к поверхности. Вычислено, что если бы каждая молекула яичного альбумина, которая диффундирует к поверхности, оставалась на ней, то поверхность 0 05 % - ного раствора яичного альбумина была бы полностью насыщена уже в течение 0 58 сек. Существует несколько возможных причин медленного достижения равновесия. Be-роятно, одной из самых важных причин является то, что нативный яичный альбумин по существу поверхностно-неактивен, и только после того как нативная молекула денатурирована на поверхности, она становится поверхностно-активной. Перенос нативной молекулы в поверхность, где она может поверхностно денатурировать, встречает энергетический барьер, который должен быть преодолен, прежде чем может образоваться поверхностно-активный денатурированный яичный альбумин. [47]
В заключение необходимо обратить внимание на те трудности, которые возникают при изучении термодинамики и кинетики реакции денатурации из-за необратимости этого процесса для большинства белков. Известны лишь немногие случаи обратимой денатурации - например, для трипсина, химотрипсина, рибонуклеазы и ингибитора трипсина. Не следует думать, что немногочисленность известных случаев обратимой денатурации - это лишь следствие недостаточности наших знаний об условиях обращения процесса для большинства белков. Напротив, необратимость денатурации белков, построенных относительно более сложно и менее жестко, чем перечисленные выше, является закономерным следствием ничтожной вероятности полного восстановления чрезвычайно сложной системы связей, стабилизирующих конформацию полипептидных цепочек в нативной молекуле. Однако при рассмотрении обратимых реакций термодинамические и кинетические характеристики наиболее доступны и полнее выявляются. Возможно поэтому, что особый интерес представит в будущем выявление и исследование промежуточных состояний денатурируемого белка, сколь бы кратковременно ни было их существование. [48]
Медленное достижение конечного значения поверхностного натяжения таких растворов происходит отнюдь не от медленной скорости диффузии молекул белка к поверхности. Вычислено, что если бы каждая молекула яичного альбумина, которая диффундирует к поверхности, оставалась на ней, то поверхность 0 05 % - ного раствора яичного альбумина была бы полностью насыщена уже в течение 0 58 сек. Существует несколько возможных причин медленного достижения равновесия. Be-роятно, одной из самых важных причин является то, что нативный яичный альбумин по существу поверхностно-неактивен, и только после того как нативная молекула денатурирована на поверхности, она становится поверхностно-активной. Перенос нативной молекулы в поверхность, где она может поверхностно денатурировать, встречает энергетический барьер, который должен быть преодолен, прежде чем может образоваться поверхностно-активный денатурированный яичный альбумин. [49]
Следовательно, молекула нативной альдолазы должна быть тетрамером. Образующиеся субъединицы ведут себя одинаково при ультрацентрифугировании и не разделяются при электрофорезе. Кроме того, было показано, что каждая из этих субъединиц имеет на С-конце тирозин. Все это говорит о том, что субъединицы, составляющие молекулу альдолазы, идентичны или, во всяком случае, очень сходны друг с другом. Следовательно, диссоциация нативных молекул на субъединицы должна сопровождаться развертыванием этих последних. [50]