Нанесение - проба
Cтраница 2
После нанесения проб хроматографическую бумагу протягивают до стартовой линии, не касаясь нанесенных проб, через 50 % - ный раствор ДМФА в ацетоне или этаноле, находящийся в эмалированной кювете. Затем бумагу отжимают между листами фильтровальной бумаги и проделывают ту же операцию с другим ее концом. После этого в течение 10 мин испаряют на воздухе растворитель с поверхности бумаги, а затем последнюю помещают в герметично закрываемую хроматографическую камеру, насыщенную предварительно в течение ночи парами системы растворителей: ДМФА - гексан. Разделяют методом нисходящей бумажной хроматографии до тех, пор, пока подвижный растворитель ( гексан) не пройдет хроматографический путь, равный 40 см. Затем хроматограмму сушат на воздухе и проявляют. [16]
После нанесения пробы хроматограмму вкладывают в хро-матографическую камеру и начинают элюирование. При этом необходимо знать, какое количество вещества неподвижной фазы содержится в подвижной фазе, которая используется для элюирования. Гидрофильные элюенты, чаще всего на основе бутанола, или даже однофазные элюенты ( например, смесь изо-пропиловый спирт - вода) содержат такое количество воды, что в ходе элюирования бумага может впитать из них необходимую воду и набухнуть. В этом случае хроматографирование можно начинать немедленно и получить в результате пятна также правильной круглой формы; это обстоятельство доказывает, что разделение происходит по принципу распределительной хроматографии. Однако, если содержание воды в подвижной фазе невелико, ниже примерно 10 % ( а это имеет место при использовании таких систем, как бутилацетат - вода, бензол - пропи-оновая кислота - вода, тетрахлорметан - уксусная кислота - вода, системы Буша и др.), необходимо до начала элюирования ввести в бумагу требуемое количество полярной неподвижной фазы. [17]
После нанесения пробы прибор закрывают крышкой, на нижнюю поверхность которой прикрепляют лист фильтровальной бумаги, чтобы конденсирующаяся на крышке жидкость не попадала на электрофореграммы. [18]
 |
Схема устройства для нанесения на хроматограммы большого числа проб. [19] |
После нанесения пробы полоску бумаги помещают в хроматографическую камеру с растворителем. [20]
После нанесения пробы на хроматографическую пластинку хроматограмму проявляют. Для этого заставляют растворитель двигаться по слою под действием капиллярных сил. При движении растворителя через пятно смеси адсорбированных веществ равновесие сдвигается и вещества десорбируются, причем более прочно адсорбированный компонент десорбируется в меньшей степени, чем менее прочно адсорбированный компонент. Десорбированный компонент переходит в раствор и переносится к краю пятна, где приходит в соприкосновение со свежим адсорбентом. При этом он вновь адсорбируется и устанавливаются новые равновесные условия. Таким образом, состав движущегося раствора непрерывно меняется вследствие распределения вещества между адсорбентом и растворителем. [21]
Для нанесения проб на пластинки, которое проводилось в самых разных условиях, Брейн и сотрудники использовали капилляр, отрезанный так, чтобы в нем удерживался заданный объем раствора ( Microcap, фирма Drummond), и устройство на основе шприца Гамильтона для многократного ввода пробы. [22]
Для нанесения проб используют микропипетки различных емкостей и конструкций. Точность градуировки пипеток различна, поэтому при количественных анализах нужна повторная калибровка. Если требуется точное нанесение очень небольших количеств пробы, то применяют микрошприцы. При нанесении проб шприцами и микропипетками обычно используют специальный штатив, в котором их закрепляют. [23]
После нанесения проб пластинку помещают в специальную хроматографическую камеру для разгонки. Такая камера представляет собой толстостенный сосуд с хорошо притертой крышкой; она должна иметь совершенно гладкое дно, при котором получается ровное развитие фронта растворителя. Для получения воспроизводимых результатов необходимо, чтобы насыщение воздуха парами растворителя в камере было постоянным. Часто наблюдается, что одни и те же вещества, находящиеся у края пластинки, движутся быстрее веществ, расположенных посередине. Такие краевые эффекты возможны особенно в тех случаях, когда подвижный растворитель состоит из сильно различающихся по полярности компонентов. Это происходит, видимо, в результате более сильного испарения растворителя с краев пластинки из-за неравномерного насыщения камеры его парами перед хроматографическим разделением. Во время хро-матографирования следует избегать прямого попадания солнечного света на хроматографическую камеру, так как даже малейшее одностороннее нагревание ее, создающее перепад температур внутри камеры, вызывает нежелательное искривление фронта растворителя. Для равномерного насыщения внутри камеры иногда подвешивают фильтровальную бумагу, смоченную в растворителе. При разгонке в таких камерах Rf веществ, как правило, уменьшается. Длительность разгонки хрома-тограмм зависит от степени насыщения камеры, толщины слоя сорбента, температуры, природы растворителя и размещения пластинок в камере. [24]
Для нанесения проб используют стеклянные платино-иридие-вые капилляры, микропипетки, шприцы, а также специальные дозирующие устройства. В ВЭТСХ для дозирования нанолитровых объемов были разработаны самозаполняющиеся платино-иридие-вые капилляры с максимальным объемом дозирования 22 нл на 1 м длины. При отборе одной и той же пробы подобным капилляром воспроизводимость введения пробы составляет 0 7 % от ее объема. [25]
После нанесения проб бумагу помещают за 6 ч до начала анализов в лодочку с подвижным растворителем, которая укреплена в верхней части хроматографической камеры, насыщенной парами неподвижного и подвижного растворителей. При разделении кислот хроматограммы извлекают из камеры через 18 - 20 ч, сушат 30 - 60 мин на воздухе и проявляют. Для этого хромато-грамму орошают раствором хлорида железа. Производные кислот проявляются в виде фиолетовых пятен. [26]
 |
Общий вид прибора фирмы Грнффпн и Джордж. [27] |
После нанесения пробы газа или жидкости при помощи шприца на сорбент через резиновый колпачок начинают проявление хроматограммы азотом из газового баллона. [28]
После нанесения пробы экстракта пластинку нагревали 3 мин при 104 С, чтобы перевести красители в хроматографируемые соли. Полиуридиловая кислота образовывала комплексы с комплементарными олигонуклеотидами дезоксиаденозина, в результате чего последние в процессе разделения оставались в стартовой точке. При использовании этой методики необходимо контролировать температуру. [29]
 |
Двумерная хроматограмма ( 13X13 см 1 мкг ДНФ-прокзводных аминокислот ( с разрешения авторов и Birkhaeuser Verlag. [30] |
Страницы: 1 2 3 4