Cтраница 3
Все окислительные агенты, вызывающие посинение гваяковой настойки, изменяли окраску спиртовой вытяжки. Все вещества, способные обесцвечивать гваяковую настойку ( например, сероводород), обесцвечивали окрашенную спиртовую вытяжку. Шенбайн сделал вывод, что в ткани гриба содержится хромогенное вещество, способное окисляться озонированным кислородом, подобно веществам гваяковой смолы. Тот факт, что эти вещества в паренхиме гриба не окрашиваются в обычных условиях, свидетельствовал, по его мнению, 6 существовании в ткани другого вещества, могущего активировать атмосферный кислород, делая его способным к окислению. [31]
Для того чтобы активация оксидазы при гваяковой реакции была более заметна, необходимо сильно разбавлять раствор оксидазы, так как в противном случае синее окрашивание очень быстро наступает и без прибавления пероксидазы. Исходный сок грибов Lactarius нужно для этого разбавить в 100 раз, раствор-сырец оксидазы - в 50 раз. В три пробирки а, 6 и с наливают равные количества гваяковой настойки и разбавленного раствора оксидазы; в пробирку а прибавляют, кроме того, 5 капель раствора пероксидазы, в пробирку b - 5 капель раствора пероксидазы, ин-активированного длительным кипячением или отравлением. В то время как в пробирке а появляется темносинее окрашивание уже по истечении нескольких минут, пробы бис начинают окрашиваться только после многочасового стояния. [32]
Во многих случаях мы могли констатировать, что между реакцией с гваяковой настойкой на оксидазу и выделением иода из йодистого калия существует строгий параллелизм в смысле относительной интенсивности обеих реакций и локализации окислителя в клетке. [33]
В отсутствии перекисей пероксидаза не оказывает ни малейшего окисляющего действия. Свежеприготовленная гваяковая настойка не окрашивается пер-сксидазой; однако гваяковая настойка, простоявшая лишь несколько часов, окрашивается более или менее интенсивно в синий цвет раствором пероксидазы. Как уже было доказано Шенбейном46, пероксидаза активирует перекись водорода не только по отношению к гваяковой настойке, по и к крахмальному раствору с йодистым калием. Она также активирует все перекиси, образующиеся при окислении органических соединений воздухом. Новые данные Линоссье47, Гунгера48, а также Баха и Шода49 только подтверждают наблюдения, сделанные уже Шенбейном. [34]
Эти наблюдения, как и все другие наблюдения этого выдающегося исследователя, вполне верны, по выводы, которые из них сделал Шенбейн, оказались несоответствующими действительности. Он предполагал, что ускорение окислительного действия перекиси водорода и разложение последней с выделением недеятельного, молекулярного кислорода происходят под влиянием одних и тех же веществ, которые он смешал с ферментами вообще. Он говорит о правиле, в силу которого вещества, которые разлагают перекись водорода подобно платине, также окрашивают в синий цвет гваяковую настойку, содержащую перекись водорода. [35]
Асо исследовал также сок, полученный из клубней Sagittaria sagittifolia, и нашел, что он совершенно не содержит нитритов. Если бы он исследовал клубни по указанному нами способу, он мог бы убедиться, что, несмотря на отсутствие нитритов, они обладают способностью выделять иод из йодистого калия. Если свежий срез клубней Sagittaria соприкасается с бумагой, пропитанной йодистым калием с крахмалом, то через короткий промежуток времени в месте соприкасания появляется фиолетовое кольцо, которое соответствует периферическим слоям клеток в клубне. На бумаге, пропитанной гваяковой настойкой, получается аналогичным образом тем-носинее кольцо, на пропитанной ж-фенилендиамином - яркосинее кольцо. Все три отпечатка в точности совпадают, что еще раз доказывает локализацию окислительного начала в тех же периферических слоях клеток. [36]
Это положение Шенбайн последовательно подкреплял экспериментами. Им было показано, что реакция окисления гваяковой настойки препаратами из красных кровяных телец и клейковины пшеницы зависит от присутствия перекиси водорода. [37]
Посредством иодокрахмальной реакции мы могли также доказать2, что образование перекисей - поскольку на него указывает выделение иода из йодистого калия - имеет место не только в выделенном растительном соке, но и в живой клетке. То, что обработанные таким образом клетки еще живы, было доказано последующими опытами плазмолиза. И в этом случае наблюдался полный параллелизм между реакцией с гваяковой настойкой на оксидазу и выделением иода, ибо срезы, взятые из середины картофельных клубней, не давшие синего окрашивания с гваяковой настойкой, не обнаружили также и под микроскопом после обработки раствором йодистого калия ни малейшего синего окрашивания крахмальных зерен. Впоследствии мы доказали3, что разложение йодистого калия вызывается именно оксидазой, а не какой-нибудь другой составной частью клетки или растительного сока: из грибов ( Russula foetens, Lactarius vellereus) была приготовлена оксидаза; которая наряду с обычными реакциями на оксидазы обладала способностью чрезвычайно энергично выделять иод из йодистого калия. Идентичность того начала, которое вызывает посинение гваяковой настойки, с тем, которое выделяет иод из йодистого калия, таким образом была доказана с полной достоверностью. [38]
По вопросу о существовании животной оксидазы, вызывающей посинение гваяковой настойки и другие реакции оксидаз, существует много противоречивых данных. Новые взгляды на природу оксидаз, принятые в течение последних лет, начинают вносить некоторую ясность в путаницу, имевшуюся в этой области ( см. Животные пероксидазы, стр. Так, например, упомянутые выше противоречия можно объяснить тем, что пероксидаза, всегда имеющаяся в препаратах животного происхождения, дает в присутствии перекиси те же самые реакции, как и простая оксидаза. Все данные о существовании в животных организмах оксидазы, действующей на гваяковую настойку, должны быть, следовательно, проверены со всеми известными предосторожностями. [39]
Как было упомянуто выше, в растениях существуют по крайней мере две пероксидазы. Одна из них активирует оксигеназы энергичнее, чем перекись водорода, а другая обладает противоположным свойством. Этот факт был установлен Бахом и Шода50 не только качественно, но также и количественно. Из опытов, относящихся к поведению пероксидазы по отношению к различным цветным реакциям ( гваяковая настойка, гваякол, парафенилеидиамин, тетраметилпарафенилендиамин в присутствии На02), Асо51 выводит также заключение, что в растениях существуют но меньшей мере две пероксидазы. [40]
Устанавливают проволочную подставку для реактивных бумажек, помещают сбоку подставки цветную карту и часы и ослабляют пробки склянок. Следят за секундной стрелкой часов и при нуле секунд вынимают пикратную бумажку, закрывают склянку и подвешивают бумажку с помощью зажима на проволочную подставку. В то время как наблюдают за Пикратной бумажкой - время и цвет по карте - берут в зажим бумажку с медным купоросом и при ноле секунд погружают ее в раствор фенолфталина, немедленно закрывают склянку, стряхивают лишний раствор и подвешивают бумажку. Продолжая наблюдение за реактивными бумажками, помещают другую бумажку с медным купоросом в зажим, когда стрелка близка к нулю, погружают в гваяковую настойку и затем подвешивают. Следят за гваяковой бумажкой в течение первой минуты и всеми другими бумажками за каждой по минуте до тех пор, пока пикратная бумажка не будет подвергнута экспозиции в течение 5 минут. Делают окончательный вывод о концентрации синильной кислоты. Концентрация в 100 частей на миллион - безопасна в течение одного часа; 500 частей на миллион - опасна. [41]
Посредством иодокрахмальной реакции мы могли также доказать2, что образование перекисей - поскольку на него указывает выделение иода из йодистого калия - имеет место не только в выделенном растительном соке, но и в живой клетке. То, что обработанные таким образом клетки еще живы, было доказано последующими опытами плазмолиза. И в этом случае наблюдался полный параллелизм между реакцией с гваяковой настойкой на оксидазу и выделением иода, ибо срезы, взятые из середины картофельных клубней, не давшие синего окрашивания с гваяковой настойкой, не обнаружили также и под микроскопом после обработки раствором йодистого калия ни малейшего синего окрашивания крахмальных зерен. Впоследствии мы доказали3, что разложение йодистого калия вызывается именно оксидазой, а не какой-нибудь другой составной частью клетки или растительного сока: из грибов ( Russula foetens, Lactarius vellereus) была приготовлена оксидаза; которая наряду с обычными реакциями на оксидазы обладала способностью чрезвычайно энергично выделять иод из йодистого калия. Идентичность того начала, которое вызывает посинение гваяковой настойки, с тем, которое выделяет иод из йодистого калия, таким образом была доказана с полной достоверностью. [42]
Если подвергнуть раствор оксидазы из Lactarius методическому фракционированному осаждению спиртом, соединяя соответственные фракции и вновь осаждая, то получаются в конце концов две фракции, из которых одна совершенно не обладает окислительными свойствами, а другая обладает ими лишь в слабой степени. Последняя фракция, которая почти не растворима в 40 % - ном спирте, энергично активируется перокси-дазами различного происхождения. Слабоокисляющую фракцию, которая главным образом действует как переносчик кислорода, поглощая молекулярный кислород с образованием перекиси, мы будем обозначать в дальнейшем как оксигеназу, в то время как для фракции, не обладающей окислительной способностью, но активирующей перекиси, мы сохраним обозначение пероксидаза. Следует здесь отметить, что в то время, как из оксидазы, извлеченной из грибов Lactarius, сравнительно легко приготовить препараты пероксидазы, не содержащие оксигеназы ( не окрашивающие в синий цвет гваяковую настойку), нам до сих пор еще не удалось получить оксигеназу, совершенно не содержащую пероксидазы. В соответствии с этим Бертран1 указывает, что ему не удалось полностью очистить лакказу от марганца. Тот факт, что пероксидаза прочно удерживается оксигеназой, не является удивительным, так как ферменты вообще очень легко увлекаются и очень прочно удерживаются различными осадками. [43]
В первую очередь обращает на себя внимание полный параллелизм между гваяковой и иодокрахмальной реакциями. Растения, окрашивающие немедленно гваяковую настойку, дают без исключения также и положительную иодокрахмальиую реакцию. Чем сильнее одна из этих реакций, тем интенсивнее и другая. Только в случае чрезвычайно медленно действующих оксидаз, окрашивающих гваяковую настойку лишь очень постепенно, нельзя с полной достоверностью установить выделение иода. Как показало изучение многочисленных отпечатков срезов растений на иодокрахмальной и на гваяковой бумажке, в обоих случаях окислительное начало одно и то же и всегда локализовано в периферических слоях клетки. [44]
Мы повторили опыты Асо с почками Sagittaria и нашли, что его данные правильны в случае кратковременного нагревания, после которого водная вытяжка вызывает еще заметное разложение йодистого калия. Однако, если кипятить ее в течение 3 - 4 минут, то она полностью теряет способность разлагать йодистый калий. Полученная нами водная вытяжка была красновато-коричневой и поэтому совершенно не годилась для реакции Грисса. Довольно активный в начале экстракт потерял по истечении 24 часов свою окислительную способность по отношению как к гваяковой настойке, так и к йодистому калию с крахмалом, что также говорит против наличия нитрита. [45]