Cтраница 4
Денатурированные белки обычно менее растворимы, чем нативные формы, их физиологическая активность при денатурации теряется. Вероятно, теряется и способность существовать в кристаллическом состоянии, так как ни один денатурированный белок не был выделен в кристаллической форме. [46]
Это мнение трудно проверить экспериментально, поскольку лишь немногие свойства денатурированных белков поддаются количественному измерению. Нерастворимость денатурированного белка не может быть использована как критерий денатурации, так как коагулят нерастворимого денатурированного белка может адсорбировать молекулы нативного белка и, наоборот, само свертывание денатурированного белка может тормозиться благодаря защитному действию остающегося в растворе нативного белка. [47]
Уже много лет назад было известно, что некоторые нативные белки устойчивы к действию трипсина и что протеолиз легко протекает после денатурации белков. Зная количество основных аминокислот в белке, можно точно предсказать, сколько пептидов может образоваться при триптическом гидролизе денатурированного белка. [48]
В спектре ренатурированного белка эти пики занимают более широкую область вплоть до - 0 3т в слабое поле и имеют более сложную структуру. При этом значении рН пики узкие, поскольку протонный обмен с растворителем протекает медленно в шкале времени ЯМР даже для денатурированного белка. Однако этот процесс катализируется основаниями ( см. разд. NH-групп уширяются я исчезают. В условиях частичного обмена вид спектра меняется. Отнесение индивидуальных линий в этой области до сих пор не сделано. [49]
После прибавления 1 л раствора, содержащего 160 г уксусной кислоты и 300 г ацетата натрия, раствор энергично встряхивают на механической качалке со смесью 3 3 л хлороформа и 1 7 л к-амилового спирта в течение 10 мин и затем центрифугируют в течение 30 мин. Надосадочный водный раствор отделяют сифонированием и остаток снова обрабатывают смесью н-амиловый спирт - хлороформ, пока на поверхности раздела фаз не перестанет появляться денатурированный белок. К водному раствору гиалуроновой кислоты прибавляют 4 л 95 % - ного спирта и отделяют осадок центрифугированием. Его растворяют в минимальном количестве воды и диализуют против проточной водопроводной воды в течение 24 час. [50]
Это мнение трудно проверить экспериментально, поскольку лишь немногие свойства денатурированных белков поддаются количественному измерению. Нерастворимость денатурированного белка не может быть использована как критерий денатурации, так как коагулят нерастворимого денатурированного белка может адсорбировать молекулы нативного белка и, наоборот, само свертывание денатурированного белка может тормозиться благодаря защитному действию остающегося в растворе нативного белка. [51]
Принято считать, что процесс денатурации сопровождается раскручиванием полипептидных цепей, изменением структуры, характерной для природного белка. В коагуляте денатурированного гемоглобина или денатурированного овальбумина раскрученные полипептидные цепи различных молекул данного белка настолько переплетены между собой, что их уже нельзя разделить, чем и объясняется нерастворимость денатурированного белка. Некоторые химические реагенты, к числу которых относятся сильные кислоты, сильные щелочи и спирты, служат сильными денатурирующими средствами. [52]
Образовавшуюся эмульсию охлаждают сначала при комнатной температуре до - 25 С, а затем 1 - 2 ч в холодильнике до 4 - 5 С. В результате 30-минутного центрифугирования ( 1000 g) смесь разделяется на три слоя: а) верхний водный, содержащий липополисахарид и нуклеиновую кислоту; б) промежуточный фенольный, содержащий белок, и в) нижний, содержащий остатки разрушенных клеток и денатурированный белок. На поверхности раздела фенольной и водной фаз может находиться нерастворимый остаток. Водный слой отделяют с помощью сифона, а органический - дважды экстрагируют водой ( 400 мл), нагретой до 68 С. Получающийся при диализе раствор может быть мутноватым. Раствор упаривают до объема - 100 мл при - 40 С и после центрифугирования лиофилизуют. Выход неочищенного препарата липополисахарида составляет 6 - 8 %, считая на вес сухих клеток. Как правило, в продукте содержится приблизительно 50 % липополисахарида и столько же рибонуклеиновой кислоты. [53]