Cтраница 4
Предположим, что мы имеем белковый раствор, в котором имеются три фракции, различающиеся между собой электрофоретическими скоростями и, и и и, причем электрофоретическая скорость и имеет наибольшую величину, а и наименьшую. На схеме рис. 82 эти фракции обозначены соответственно черными и белыми кружками. Фракция промежуточной скорости и обозначена наполовину зачерненным кружком. После удаления избытка исходного белка и заполнения верхней части трубки буферным раствором ( рис. 82, а) прибор устанавливается в исходное положение ( рис. 82, б) и включается электрическое поле. Направление поля таково, что частицы белков, имеющих одинаковый знак заряда, но различную скорость смещения, передвигаются слева направо. [46]
Нерастворимые белки, или склеропротеины, находятся в организме животного в твердом состоянии; они обеспечивают механическую прочность органов ( опорные белки) или защищают от внешних воздействий. Растения не содержат склеропротеинов; их роль в растениях выполняет целлюлоза. Склеропротеины растворяются только в концентрированных кислотах и основаниях при нагревании ( один из них - коллаген - даже в кипящей воде), но это растворение сопровождается деструкцией макромолекул; из полученных растворов исходный белок не регенерируется. Будучи нерастворимыми, склеропротеины, разумеется, не подвергаются денатурации. В природном состоянии склеропротеины не гидролизуются ферментами. [47]
Существует много вариантов иммунохимического анализа. Один из наиболее распространенных заключается а следующем. На диске из пол и вн нил хлорида сорбируются немеченые аитнтела к исследуемому белку. Колонии прямо иа чашке Петри лизируются в мягких условиях, и поливинилхлоридный диск вводится в контакт с поверхностью чашки. Продукты с антигенными детерминантами исходного белка образуют комплексы антиген - антитело с антителами, сорбированными на диске только в местах положения экспрессирующих клоиов. Затем диск отмывается от иеспецифи-чески сорбированного антигена и обрабатывается раствором с меченными ( радиоактивно, флуоресцентно илн иммуноферментно) антителами. По положению меченых участков на диске легко идентифицировать экспрессирующие колонии. [48]
При тепловой обработке мясных продуктов при 60 - 70 С начинается денатурация белков. Вначале разрушается третичная структура миофибриллярных и саркоплазменных белков с выде-чением свободной воды. При некоторых условиях эта вода может затем внедриться во вторичную структуру соединительной ткани ( коллагена и эластина) с образованием желатиноподоб-ных соединений. Происходит частичный гидролиз мышечных белков с образованием растворимых в воде продуктов, в том числе пептидов и аминокислот. Общее количество этих продуктов может достигать 10 % исходного белка. При варке эти азотистые вещества переходят в бульон, где участвуют в образовании пенки; при жарении остаются на жарочной поверхности вместе с сырьем. [49]
Однако, если гидролизовать ДНФ-белок лишь частично, можно получить ДНФ-пептиды, исследование строения которых дает указания относительно природы аминокислот, расположенных в пептидных цепях вблизи концевых групп. ДНФ-пептиды довольно хорошо поддаются отделению от незамещенных пептидов и аминокислот путем экстракции органическим растворителем из подкисленного раствора и хроматографическим фракционированием на силикагеле. Смеси ДНФ-пептидов, полученные этим способом, гораздо менее сложны, чем продукты частичного гидролиза необработанного белка, так как отделяются только пептиды, содержащие N-концевые группы исходного белка. [50]
Технология рекомбинантных ДНК позволяет выделять гены любых белков, существующих в природе, экспрессировать их в специфическом хозяйском организме и получать чистые белковые продукты. Однако физические и химические свойства таких природных белков часто не удовлетворяют условиям, обеспечивающим возможность их промышленного применения. Иногда для получения белков, обладающих нужными свойствами, в качестве источника соответствующих генов используют организмы, растущие в необычных, зачастую экстремальных условиях. Например, для синтеза ос-амилазы, не утрачивающей своей активности при высокой температуре, выделили ее ген из Bacillus stearothermophilus - бактерии, естественной средой обитания которой являются горячие источники с температурой воды 90 С. Полученная таким образом а-амилаза оставалась активной при температурах, при которых осуществляют промышленное производство этилового спирта из крахмала. Однако число мутант - ных белков, образующихся в результате замены отдельных нуклеотидов в структурном гене с помощью обычного мутагенеза, чрезвычайно велико. Мутагенез с последующим отбором редко приводит к существенному улучшению свойств исходного белка, поскольку большинство аминокислотных замен сопровождается снижением активности фермента. [51]
Такая система позволяет получить более четкое разделение. При нанесении образца ( в объеме 40 л) элюат, не содержащий аминокислот, сливают в трап. Анализ ведут методом бумажной хроматографии. Первую колонку, содержащую основные аминокислоты, соединяют с двумя небольшими колонками ( 2 5x20 см и 1 7x13 6 см), также заполненными полистиролом. Профиль элюирования строят по данным хроматографии на бумаге. Объединяют фракции, характеризующиеся наиболее простым составом и максимальным содержанием аминокислот. Эти уже обогащенные смеси вновь фракционируют на сульфокатионите ( Zeo-Karb - 215) в различных условиях или на дауэксе-2 до получения чистых аминокислот. Не представляющие интереса промежуточные фракции отбрасывают. Условия рехроматографии выбирают с учетом состава смеси. Выход аминокислот составляет около 50 % от веса исходного белка. Важно лишь, чтобы смесь не содержала большого количества полисахаридов. [52]