Cтраница 3
Можно было бы процитировать множество вариантов метода очистки гибридных молекул от одноинтевых исходных партнеров на колонках оксиапатита, однако с хроматографической точки зрения они не представляют большого интереса. [31]
Ниже будет приведено достаточное число примеров - хроматографии как кислых, так и щелочных белков на колонках оксиапатита, но прежде - в интересах сопоставления - нам представляется целесообразным нарисовать столь же общую картину хроматографи-ческого поведения нуклеиновых кислот при их взаимодействии с этим сорбентом. [32]
Далее Бернарди и Кавазаки показали, что денатурированные белки ( в присутствии 8 М мочевины) связываются с оксиапатитом явно слабее, чем нативные. Это легко понять, если вспомнить, что в нативной конфигурации у цитоплазматических белков гидрофильные остатки аминокислот, в том числе Asp и Glu, экспонированы снаружи белковой глобулы. В статистическом клубке денатурированного белка их относительное представительство на поверхности уменьшается. Представляет интерес замеченная авторами необходимость увеличения концентрации элюирующего фосфатного буфера для снятия с колонки оксиапатита кислых белков при увеличении длины колонки. Данное явление лучше выражено для относительно небольших белков. [33]
Все сказанное выше еще в значительной степени относится к области предположений, многое в механизме сорбции кислых белков на оксиапатите остается неясным. Механизм этот явно сложнее, чем было здесь описано. [34]
Очистку плазмидной ДНК от примеси РНК ( после осаждения ДНК бактерии-хозяина из просветленного лизата) можно осуществлять в препаративном варианте на колонке оксиапатита и без участия бромистого этидия, но в присутствии 8 М мочевины, что обеспечивает сохранение однонитевой структуры РНК. [35]
В освобожденную от клеток культу-ральную жидкость добавляют К-фосфатный буфер ( рН 7 2) до концентрации 0 15 М, затем суспензию оксиапатита перемешивают на холоду в течение 3 ч, загружают в колонку, хорошо промывают тем же буфером и элюируют очищенный вирус 5 - 10 объемами колонки 0 5 М К-фосфатного буфера. [36]
Добавка в воду калгона может в результате его гидролиза привести к образованию ортофосфата в количестве, достаточном для появления накипи из основного фосфата кальция, например оксиапатита. Растворимость в воде карбоната магния значительно выше, чем карбоната кальция, и практически это вещество не образует накипи. [37]
Палиндромы в ДНК обнаруживаются путем кратковременной ренатурации денатурированной ДНК, гидролиза всей не успевшей ренатурировать ДНК нуклеазой S1 ( специфической для однонитевой ДНК) и задержания на колонке оксиапатита двунитевых фрагментов, которые в этих условиях образуют только палиндромы. Лин и Ли [ Lin, Lee, 1979 ] вели денатурацию фрагментированной ультразвуком ДНК в щелочной среде, а ренатурацию - путем быстрой нейтрализации раствора и выдерживания его при повышенной температуре в течение 2 с. Кроме того, к раствору добавляли половинный объем диоксана, который, как оказалось, почти втрое ускоряет и повышает эффективность действия фермента. [38]
Примеры использования оксиапатита для разделения одно - и двунитевых молекул нуклеиновых кислот и соответствующие практические рекомендации будут приведены в следующих разделах. Общее рассмотрение сорбции НК на оксиапатите закончим указанием на то, что на 1 мл упакованного оксиапатита можно сорбировать 0 2 - 0 5 мг ДНК, однако для целей фракционирования не следует превышать первой из этих цифр. Присутствие ЭДТА и цитрата препятствует сорбции, по-видимому, за счет блокирования кальция на поверхности сорбента. Следует упомянуть о том, что в аналитических опытах при избытке сорбента не только элюцию, но и исходную сорбцию НК на оксиапатите следует производить достаточно медленно, например в течение 30 мин, с тем чтобы дать возможность молекулам ДНК или РНК отыскать наиболее благоприятное для сорбции расположение на поверхности сорбента. [39]
В 1971 г. в сборнике Methods in Enzymology была опубликована серия статей, посвященных методам очистки и фракционирования факторов инициации, элонгации и терминации белкового синтеза. В них описано использование для этих целей оксиапатита - как в варианте ступенчатой элюции с колонки, так н в объеме. [40]
Мы привели довольно длинный список широко известных адсорбентов, которые не используются is интересующих нас хромато-графических методах очистки и фракционирования биополимеров, для того чтобы освободить подход к практически единственному варианту адсорбционной хроматографии, который широко и плодотворно применяется для этой цели. Речь идет о хроматографии белков и НК на оксиапатите. [41]
ДНК бромистый этидий интер-калирует легче, чем в сверхскрученную. Более интенсивная интер-каляция приводит к менее прочной сорбции на оксиапатите. Смесь линейной и плазмидной ДНК сорбировали в объеме на смесь ок-сиап тита с целитом в присутствии раствора бромистого этидия, концентрацию которого подбирали так, что интеркаляция в линейную ДНК шла на уровне одной молекулы красителя на 3 - 4 пары оснований, в то время как в плазмидную ДНК интеркалировала одна молекула бромистого этидия в среднем на 6 пар оснований. [42]
Напротив, ввиду своего гигантского размера она задерживалась на оксиапатите, в то время как вирусная ДНК элюировалась ( / 5 М Na-фосфатньш буфером. Осветленный центрифугированием экстракт вносили прямо на колонку оксиапатита ( из расчета 1 мл сорбента на 5 - Ю15 клеток), уравновешенную лизирующим раствором. [43]
Гофман [76] разделял 1 - и 2-моноглицериды на тонких слоях оксиапатита при 10 С, используя как элюирующий растворитель метилизобутилкетон. В отличие от элюирования на слоях силика-геля при хроматографировании на оксиапатите не удается достаточно четко разделить 1 2 - и 1 3-диглицериды. [44]
После охлаждения раствора добавляли 15 г оксиапатита и тщательно перемешивали до получения однородной суспензии. Поскольку введение алебастра в качестве связующего улучшает разделение, 15 г оксиапатита смешивали с 1 2 г алебастра и диспергировали в 60 мл воды, энергично встряхивая смесь в закрытой склянке. [45]