Cтраница 4
Так, например, ионообменная хроматография - все еще типичный метод разделения нуклеотидов, однако для разделения оснований ее почти не применяют, отдавая предпочтение тонкослойной или бумажной хроматографии. При разделении нуклеиновых кислот ионитам также предпочитают другие сорбенты, в частности оксиапатит, диатомитовые земли, покрытые слоем метилальбумина. [46]
После отмывки мелких частиц и остатков щелочи фосфатным буфером получают материал ( кристаллы размером около 300 мкм), обладающий описанными ниже уникальными сорб-ционными свойствами и вместе с тем обеспечивающий ( в отличие от брушита) приемлемые скорости течения элюента через заполненную им колонку. Описаны и другие, существенно не отличающиеся от приведенного, варианты приготовления оксиапатита. Уже упоминалось, что продажные препараты в сухом виде ( Bio-Gel HTP) и в виде суспензии ( Bio-Gel HT) поставляются фирмой Bio-Rad и рядом других фирм. В лабораторных условиях гранулированный оксиапатит с аналогичными характеристиками можно получить, вводя в раствор при осаждении брушита центры конденсации, которыми служат частицы силикагеля размеро. [47]
Из общих свойств оксиапатита отметим еще то, что OHi легко растворим в 25 % - ном водном растворе ТХУ. Рассмотрим теперь несколько примеров фракционирования и очистки белков и НК на колонках оксиапатита. [48]
NaCl при малой концентрации фосфата снимает с оксиапа-тита гистоны, тогда как негистоновые белки хроматина ( НБХ) остаются сорбированными. Эти белки носят заметно более кислый характер, поэтому для их десорбции с оксиапатита, помимо присутствия 2 М NaCl, необходимо увеличение концентрации фосфатного буфера. Например, хроматин, извлеченный из ядер печени мыши ( до 20 мг по ДНК), растворяли в 0 001 М Na-фосфатном буфере, содержащем 2 М NaCl и 5 М мочевину, дробили ультразвуком и вносили на колонку оксиапатита ( 1 6 X 25 см), уравновешенную тем же раствором. [49]
Краситель Phenyl Neutral Red ( PNR) интеркалирует в молекулы ДНК, причем преимущественно в ГЦ-богатые участки. Оказалось, что такая интеркаляция заметным образом уменьшает силу сорбции двунитевой ДНК на оксиапатите. [50]
Другое дело - жесткий фрагмент двунитевой ДНК. В силу его жесткости вытесненный из связи фосфат ДНК останется вблизи своего партнера на поверхности оксиапатита. Прежде чем разорвутся удерживающие фрагмент две другие связи, этот фосфат ДНК может в силу конкурентного характера замещения фосфатом элюента восстановить связь с ионом кальция и, в свою очередь, принять участие в удержании всего фрагмента в области связывания. [51]