Cтраница 4
Как отмечалось выше, для некоторых аминокислотных остатков может наблюдаться пост-трансляционная модификация. В некоторых случаях это не вызывает особых трудностей; действительно, если один или два остатка модифицированы, их положение ( я) среди соседних остатков последовательности можно легко определить. В других случаях пост-трансляционная модификация может создавать трудности при определении первичной структуры белков. [46]
Одна из ключевых проблем такого подхода - специфическое связывание определенных оснований с контрастирующей группой ( один или несколько тяжелых атомов, сильно рассеивающих электроны) - может быть решена химическими методами. Попытки использования изложенного принципа предпринимаются, однако пока без большого успеха. Это, вероятно, объясняется использованием в настоящее время для введения контрастирующих групп таких реакций, специфичность и количествен-ность которых исследованы явно недостаточно. Тем не менее если учесть, что для определения первичной структуры с помощью электронной микроскопии достаточно, по-видимому, 102 - 103 молекул полинуклеотида, то становится очевидной актуальность разработки методов специфического введения контрастирующих групп. [47]
Общим типом структуры для всех трех соединений является тетра-пептидная последовательность на N-конце. Доказано, что 3-эндорфин ( 31 АМК) образуется путем протеолиза из более крупного гипофизарного гормона 3-липотропина ( 91 АМК); последний вместе с АКТГ образуется из общего предшественника-прогормона, названного проопиокортином ( является, таким образом, препрогормоном), имеющим молекулярную массу 29 кДа и насчитывающим 134 аминокислотных остатка. Биосинтез и освобождение проопиокортина в передней доле гипофиза регулируется кортиколиберином гипоталамуса. С помощью техники клонирования ДНК, а также метода определения первичной структуры нуклеиновых кислот Сенджера в ряде лабораторий была раскрыта нуклеотидная последовательность мРНК - предшественника проопиокортина. Эти исследования могут служить основой для целенаправленного получения новых биологически активных гормональных лечебных препаратов. [48]
Под первичной кристаллизацией понимают рост кристаллитов из расплава при затвердевании сварочной ванны. В результате образуется так называемая первичная структура. У таких металлов, как алюминий, медь, никель и их сплавы, при дальнейшем охлаждении первичная структура не изменяется или изменяется незначительно. Для определения первичной структуры необходимо знать условия ее образования и влияющие на нее факторы. [49]
Методы, используемые для решения этой проблемы, описаны в разд. Другой интересный случай относится к зависимому от витамина К карбоксиметилированию остатков глутаминовой кислоты в некоторых факторах, определяющих свертываемость крови. Возникающие при этом карбоксильные группы расположены на углеродном атоме. Следовательно, при кислотном гидролизе происходит декарбоксилирование и не удивительно, что в протромбине вплоть до 1973 г. не удалось обнаружить - карбоксиглутами-новую кислоту. В гликопротеинах углеводные остатки обычно присоединены к боковым группам аспарагина или серина и их присутствие может быть помехой при определении первичной структуры с помощью протеиназ. Кроме того, количество гексозных остатков, присоединенных к белку, может меняться от молекулы к молекуле, многократно увеличивая число фрагментов, содержащих одну и ту же последовательность аминокислотных остатков. [50]
К настоящему времени расшифрована первичная структура десятков тысяч разных белков, что является несомненным достижением биохимии. Однако это число ничтожно мало, если учесть, что в природе около 1012 разнообразных белков. Под первичной структурой подразумевают порядок, последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Зная первичную структуру, местоположение каждого остатка аминокислоты, можно точно написать структурную формулу белковой молекулы, если она представлена одной полипептидной цепью. Если в состав белка входит несколько полипептидных цепей, объединенных в одну белковую молекулу посредством дисульфидных связей и нековалент-ных взаимодействий, или если одна полипептидная цепь содержит внутренние дисульфидные связи, то задача определения первичной структуры несколько осложняется, так как необходимо предварительное разъединение этих цепей и связей. Разъединение таких полипептидных цепей производят с помощью денатурирующих агентов ( растворы 8М мочевины или 6М гуанидингидрохлорида), разрывающих нековалентные связи. [51]
Бактерии Vibrio cholerae продуцируют белок, который не является нейротоксином, но тем не менее интересен как своей способностью связывать ганглиозид GMI, так и механизмом действия. Этот токсин связывается со слизистой кишечника и стимулирует секреторные клетки тонкой кишки до такой степени, что организм теряет воду и электролиты в опасно больших количествах. Токсин холеры - белок с М 82000; он не содержит углеводы и липиды и селективно взаимодействует с ганглиозидом GMI - Этот белок состоит из нескольких полипептидных цепей: пяти В-цепей ( с М - 10 000), которые несут участок связывания ганглиозидов, но не дают холерной реакции, и субъединицы А ( М 28000), которая при проникновении в клетку активирует ( в присутствии NAD) аденилатциклазу путем ее ковалентной модификации и постоянной активации регулятор-кой субъединицы фермента - G - ( или N -) белка; в гл. В случае интактных клеток субъединица А токсина активна только в присутствии субъединиц В, которые, по-видимому, необходимы для связывания токсина с клеточной мембраной и проникновения через нее в клетку. Белок AI все еще сохраняет способность активировать циклазу. Определение первичной структуры В-цепи [18] позволило выявить значительную гомологию с [ i-цепыо тирео-тропного гормона, что объясняет способность субъединиц [ 5 реагировать с рецепторами этого гормона в щитовидной железе. [52]
Исследуемый белок растворяют в 70 % - ном растворе муравьиной или трифторуксусной кислоты ( концентрация белка 5 - 10 мг / мл) и добавляют сухой бромциан в 30 - 200-кратном молярном избытке по отношению к содержанию метионина. После окончания инкубации реакционную смесь разводят в 10 - 15 раз водой. При этом негидролизованный белок может выпадать в осадок и удаляется центрифугированием. Смесь пептидов подвергают лиофилизации или упаривают на роторном испарителе. Как видно из схемы, в результате расщепления полипептидной цепи на С-конце образующихся пептидов находится либо остаток го-мосерина, либо гомосеринлактон. Для того чтобы перевести все С-кон-цевые аминокислоты образующихся пептидов в лактонную форму, смесь пептидов инкубируют 1 ч в трифторуксусной кислоте при 25 С. Следует иметь в виду, что лактонная форма особенно удобна при определении первичной структуры белка на твердофазном сек-венаторе. [53]
Аминокислотные остатки цепи в зависимости от вида боковой группы R делятся на неск. К неполярным, плохо растворяющимся в воде относятся аланин, валин, лейцин, изолейцин, фенил аланин, триптофан, тирозин, метионин, глицин и цистепин. Полярные и заряженные аминокислотные остатки обладают хорошей растворимостью в воде. К полярным относятся серии, треонин, аснарагин, пролил и глутамин. Могут быть заряженными также цистеин и гистидин. В целом молекула белка несет положит, и отрицат. В первичной структуре белка заключена вся информация, определяющая его пространств, структуру и ф-ции. Определение первичной структуры полипептидной цепи производят путем частичного расщепления ее на короткие перекрывающиеся фрагменты с последующим анализом их аминокислотной последовательности, начиная с N-конца. Это удается сделать для не слишком длинных последовательностей, поэтому структуру длинных полипептидов находят, комбинируя данные для фрагментов. [54]
Отнесение резонансных линий в спектрах ЯМР к определенным атомам в макромолекулах является одним из наиболее важных условий надежного определения молекулярной структуры. Хотя в принципе для получения определенной информации о структуре достаточно провести отнесение небольшого числа резонансных линий, точность структурной информации возрастает с увеличением числа расшифрованных линий, так как в этом случае можно провести дополнительное сравнение результатов. С ростом надежности расшифровки спектров существенно возрастает также и надежность следующих из этого выводов, которые часто весьма чувствительны к ошибкам, допущенным при отнесении резонансных линий. Расшифровка спектров ЯМР Н протеинов, как правило, проводится в две стадии: сначала пытаются выяснить, какие резонансные линии относятся к аминокислотному остатку, и при этом не заботятся о том, какое положение занимает данная аминокислота в протеиновой последовательности. Таким образом во многих случаях выясняют, о какой из аминокислот идет речь. Второй шаг состоит в том, чтобы определить место этой аминокислоты в протеиновой последовательности. Как правило, эта проблема решается с помощью независимых, биохимических методов: либо с использованием биохимического аминокислотного анализа, либо косвенным путем - по восстановлению соответствующей последовательности в ДНК. Поскольку такая расшифровка спектров предполагает определение параметров, характерных для каждой последовательности аминокислот, то очевидно, что эффективность расшифровки спектров зависит от того, насколько правильно определена эта первичная структура. Неточности, допущенные в определении первичной структуры, могут быть обнаружены в результате сравнения с данными, полученными методом ЯМР. Эта расшифровка основана на сравнении расстояний, которые являются типичными для аминокислот, следующих одна за другой в последовательности. Одновременно соотношения между расстояниями используются для упорядочения элементов вторичной структуры, так что при таком последовательном отнесении резонансных линий можно получить информацию о вторичной структуре. [55]