Cтраница 4
Рассмотренный выше механизм можно назвать минимальным в том смысле, что он предполагает использование на каталитических стадиях всего двух групп белка ( Туг-248 и Glu-270), молекулы воды и иона цинка. Хотя из-за удаленности остатков His-69 и His-196 от субстрата представляется маловероятным, что они служат нуклеофилами, вполне возможно, что один из них перестает быть лигандом у атома цинка [5] и в качестве основания принимает участие в переносе протона. Эта стадия может не лимитировать скорость реакции. Однако при связывании не обнаруживается удаления какого-либо из остатков гистидина от атома цинка. Из-за стерических препятствий такой механизм менее вероятен, чем тот, в котором роль цинка заключается в поляризации кислородного атома карбонильной группы субстрата. [46]
Как и при других методах исследования, в этом случае должна существовать уверенность в том, что измеренные кинетические параметры относятся к изолированным стадиям процесса. Если в эксперименте не выполнены все измерения, необходимые для адекватной оценки индивидуальных кинетических констант, то полученные результаты не поддаются удовлетворительной интерпретации. Именно с помощью такого подхода впервые было установлено участие остатков гистидина в механизме действия химотрипсина на стадиях ацилирования и деацили-рования. [47]
Белковая структура гемоглобина более сложна. Гемоглобин млекопитающих ( в том числе человека) имеет мол. Преобладающая форма гемоглобина у взрослых людей - гемоглобин А - имеет две пары полипептидных цепей: а-цепей, каждая из которых состоит из 141 аминокислотного остатка, и р-цепей - по 146 остатков в каждой. В содержащемся в небольшом количестве у взрослых людей гемоглобине А % и в зародышевом гемоглобине F Р - цепи замещены другими полипептидами. Несмотря иа то что аминокислотные последовательности полипептидных цепей гемоглобина и миоглобина в значительной степени различаются, трехмерные структуры их чрезвычайно сходны и темы в молекулах того и другого занимают гидрофобные полости внутри свернутых полипептидных цепей. Проксимальный и дистальный остатки гистидина входят в число девяти аминокислот, которые одинаковы во всех миоглобинах и гемоглобинах у ряда изученных в этом отношении видов животных. [48]
Хотя карты разностной электронной плотности для металл-замещенных производных КАС указывают, что замещенные катионы металлов присоединяются вблизи центра связывания Zn ( II), с точки зрения структуры невозможно объяснить полную потерю ферментативной активности при замещении металла. Чтобы разрешить изменение структуры упорядоченных молекул растворителя координируемых аминокислотных остатков при замещении иона металла, необходимы трехмерные карты разностной электронной плотности металлзамещенных аналогов КАС относительно апофер-мента. Трудно ожидать, что структурные детали малых изменений конфигурации групп вблизи катиона металла или изменения упорядоченности молекул растворителя в области активного центра могут быть определены на основе разностных карт Фурье, расчи-танных только в проекции. Более того, отсутствие больших кон-формационных изменений в области активного центра не исключает возможности изменений геометрии координации при замещении иона металла за счет незначительных сдвигов координируемых остатков. Хотя центры связывания ионов Мп ( П) практически совпадают с центром связывания Со ( П), такой слабый сдвиг тем не менее сопровождается заметным уменьшением ферментативной активности. Поскольку молекула воды, координированная тетраэдрическим Zn ( II), образует часть сложной структуры упорядоченных молекул растворителя в области активного центра [37, 252], малые различия конфигурации координируемых остатков гистидина и незначительные сдвиги центров связывания замещенных катионов металла могут оказывать сильное влияние на упорядоченную структуру растворителя. Эти искажения структуры растворителя, следовательно, приведут к изменению условий протекания реакций с участием воды в области активного центра. [49]
Эти реакции широко используются для аналитических целей. Среди них широко известны нингидриновая реакция, позволяющая проводить количественное определение аминогрупп в белках, пептидах и аминокислотах, а также биуретовая реакция, применяемая для качественного и количественного определения белков и пептидов. При нагревании белка или пептида, но не аминокислоты, с CuS04 в щелочном растворе образуется окрашенное в фиолетовый цвет комплексное соединение меди, количество которого можно определить спектрофотометрически. Цветные реакции на отдельные аминокислоты используются для обнаружения пептидов, содержащих соответствующие аминокислотные остатки. Для идентификации гуанидиновой группы аргинина применяется реакция Сакагучи - при взаимодействии с а-нафтолом и гипохлоритом натрия гуанидины в щелочной среде дают красное окрашивание. Реакция Паули позволяет выявить остатки гистидина и тирозина, которые в щелочных растворах реагируют с диазобеизолсульфокислотой, образуя производные, окрашенные в красный цвет. [50]
Высокая степень гидрофобности центрального участка реакционного центра свидетельствует о том, что пять а-спиральных сегментов субъединиц Л и С, а также N-конце во и фрагмент субъединицы Т расположены а толще мембраны. Все эти I I участков и составляют мембранную часть комплекса. Спиральные участки расположены в пространстве практически перпендикулярно плоскости мембраны. Субъединица Т и цитохром с связываются с внутренней и наружной поверхностями мембраны соответственно, причем цитохром с не содержит участков, пронизывающих мембрану. По два мембранных фрагмента от каждой из субъединиц Л и С участвуют в связывании негемового железа. Более того, четыре лиганда, необходимые для связывания атома железа, обеспечиваются этими же четырьмя спиралями. Лиганды для ионов магния молекул бактериохлоро-филла - остатки гистидина - расположены у самого входа ct - спи-ральных сегментов в мембрану. Что же касается негемового железа, то в его связывании участвуют четыре остатка гистидина субъединиц Л и С и глутаминовая кислота субъединицы С. [51]
Если иод поглощается в небольших количествах белками, не содержащими - SH-rpynn, а при благоприятных условиях также и другими белками, то окисления не наблюдается и в реакцию вступают только тирозильные остатки. Однако часто даже при низких концентрациях иода незначительные побочные реакции окисления предшествуют реакциям замещения в тирозильных остатках. При высоких концентрациях иода последний связывается в количестве, превышающем то, которое эквивалентно содержанию тирозина. Несмотря на то, что иодирование сывороточных альбуминов лошади и человека ранее изучалось многими авторами [31, 130] и в отдельных случаях были получены кристаллические производные, Хьюз и Стрессл [ 131 а ] повторно исследовали условия, в которых эта реакция протекает специфично. Для того чтобы следить за ходом реакции и охарактеризовать получающиеся производные, они применили ряд аналитических и физических методов. Согласно приведенным данным, внедрение иода в 3 5-положения тирозильных остатков произойдет уже для 70 % от числа последних, прежде чем начнут протекать прочие реакции замещения. Однако до завершения процесса иодирования фенолов происходит параллельное замещение в других функциональных группах. К ним относятся, повидимому, остатки гистидина, поскольку в предыдущих работах было найдено, что имидазольное кольцо взаимодействует с избытком иода. [52]