Cтраница 1
Очистка белка, полученного из природного источника, представляет собой в большинстве случаев нелегкую задачу. Интересующий нас белок составляет иногда ничтожную часть исходного материала - менее 0 1 % сухого веса. Ненужный материал - это часто тоже белки и притом нередко близкие по своим свойствам к выделяемому белку. Из-за больших размеров и неустойчивости белковых молекул для очистки белков невозможно использовать многие обычные методы очистки органических соединений, например такие, как перегонка или экстракция органическим растворителем. Трудно представить себе химика-органика, пытающегося выделить продукт реакции, идущей с выходом всего лишь 0 1 % и к тому же дающей сотни побочных продуктов. Между тем именно такая задача часто стоит перед биохимиком, желающим исследовать физико-химические свойства или биологическую активность определенного белка. [1]
Очистку белков и нуклеиновых кислот на аффинных сорбентах часто ведут не на колонках, а в объеме - методами центрифугирования и декантации. Эти методы рассмотрены ниже наряду с аффинной хроматографией на колонках. [2]
При очистке белков используют помимо указанных выше методов фракционирования также и ряд вспомогательных процедур. Особенно важны две из них - диализ и лиофилизация. Диализ, или удаление соли из раствора белка, заключается в пассивном переносе ионов из раствора белка через непроницаемую для белка мембрану в буферный раствор; этот метод известен давно и применяется очень широко. Освобождение белка от соли путем диализа необходимо проводить на многих стадиях очистки, в частности после осаждения белка сульфатом аммония. [3]
Приведенных примеров очистки белков, по-видимому, достаточно не только для того, чтобы проиллюстрировать некоторые общие положения, но и для того, чтобы обратить внимание читателя па необходимость учета индивидуальных особенностей белка в каждом случае. [4]
При получении и очистке белков весьма желательно уже на начальных стадиях работы удалить или инактивиро-вать те ферменты, которые могут гидролиз о-вать белок. Например, при получении инсулина необходимо прежде всего инактивировать протеолитические энзимы поджелудочной железы. [5]
Со времени возникновения биохимии очистку белков проводили в основном двумя методами, а именно: осаждением белков солями или специфическими реактивами и адсорбированием на различных твердых телах. Хотя эти методы широко используются и в настоящее время ( особенно в препаративных целях), детальное описание их выходит за пределы задач этого издания. Более удовлетворительные результаты при аналитических работах дают методы хроматогра-фирования на колонках; ниже кратко обсуждаются некоторые последние усовершенствования, достигнутые в этой области. [6]
Ниже излагаются основное общие способы очистки белков, а также примеры того, как разные способы сочетаются в процессе очистки отдельных белков. В заключение рассматриваются критерии полноты очистки белков. [7]
Хорошим дополнением к описанию препаративных способов очистки белков служит раздел, касающийся повышения чувствительности диск-электрофореза в полиакриламидном геле, поскольку этот метод является общепринятым для оценки чистоты белков. Анализ функциональных групп в белках является переходной ступенью от расшифровки последовательности аминокислот в полипептидной цепи к выяснению трехмерной конфигурации белковой молекулы. Избирательная химическая модификация функциональных групп позволяет точно локализовать их положение в белковой молекуле и сделать важные выводы относительно расположения в пространстве отдельных участков полипептидной цепи белка. Предпоследняя глава книги, содержащая описание методик химической модификации и применяемых для этой цели реагентов, является как бы введением к следующей, заключительной главе, посвященной собственно изучению пространственной структуры белков. Здесь авторы кратко знакомят читателя с современным арсеналом химических и физико-химических методов исследования четвертичной структуры белков. [8]
Мы не можем здесь излагать методы очистки белков; упомянем лишь, что среди этих методов большую роль играет дробное осаждение солями, например, сульфатом аммония. [9]
В препаративных целях, особенно при очистке белков от примесей, широко используют метод молекулярных сит, или гель-хроматографию. При обработке эпихлоргидрином полисахарида дек-страна образуются различной степени выраженности поперечные связи, приводящие к формированию крупных гидрофильных зерен, нерастворимых в воде и называемых сефадексами. Благодаря большому сродству к воде зерна сильно набухают в водной среде с образованием геля, которым заполняют хроматографическую колонку. [10]
Из сказанного ясно, что выделение и очистка белков представляют собой весьма сложную задачу. Большинство из них чувствительны к нагреванию, действию кислот, щелочей, органических растворителей, ионов многих солей и других факторов. Обычные методы, применяемые при выделении органических веществ, почти непригодны в химии белка. [11]
Придумано много самых разнообразных и остроумных методов очистки белка. [12]
Для фракционирования целлюлаз применяется практически весь спектр методов очистки белков и имеющихся для этого носителей. [13]
В сравнении с хроматографическими методами все другие способы очистки белков за последние годы начинают несколько отступать на задний план. Все же следует упомянуть здесь о препаративном электрофорезе, который применяется довольно широко в разных исполнениях. Для фракционирования малых весовых количеств белков разделение смеси белков на зоны ведут в том или ином стабилизирующем наполнителе для ликвидации конвекционного перемешивания. Пригодными наполнителями являются волокна целлюлозы, в частности бумага. Бумажный электрофорез белков похож на разделение аминокислот и пептидов на бумаге, о чем мы уже говорили выше. Другой широко употребительной средой является гель крахмала, который разрезается на кусочки после завершения электрофореза, и из каждого куска элюируется содержащийся в нем белок. [14]
Резюмируя, можно сказать, что хроматографическое фракционирование и очистка белков на оксиапатите остаются пока методами эмпирическими, где предсказать результаты и дать заранее определенные рекомендации по выбору оптимальных условий элюции затруднительно. [15]