Cтраница 1
Очистка фермента на этой стадии достигается за счет денатурации белков, которые отделяют центрифугированием. Изменение рН белкового раствора следует осуществлять осторожно, по возможности не использовать сильные кислоты и щелочи. Рекомендуется добавлять уксусную кислоту, трис-буфер, карбонат натрия и др. Добавление соответствующего буфера или кислоты проводят на холоде. [1]
Качество очистки ферментов в процессе диализа следует контролировать не только по определению электропроводности растворов, но и одновременно по ферментативной активности. [2]
При очистке фермента всегда полезно установить еще вначале пределы рН и температуры, в которых он стабилен. Утрата ферментом активности во время очистки может свидетельствовать о необходимости добавления какого-то дополнительного кофактора или кофермента. Эту возможность следует проверить с помощью весьма простых методов, таких, как диализ или добавление комплексообразующих агентов в сочетании с детально разработанными методами идентификации неорганических ионов и органических соединений. Присутствие прочно связанных кофакторов и коферментов, а также наличие простетических групп легче определить в том случае, когда фермент уже почти очищен. [3]
При очистке ферментов, катализирующих превращения нуклеиновых кислот, при изучении кодирующих свойств полинуклеотидов, а также при проведении общего анализа макромолекулярных соединений биохимику приходится отмывать от примесей сотни анализируемых образцов. Их можно промывать химическими агентами последовательно; однако если эти операции проводить с каждым образцом в отдельности, то вся процедура будет чрезвычайно утомительной и займет очень много времени. Аналогичная проблема возникает также перед патологами и физиологами, и они решают ее, обрабатывая большое число препаратов одновременно. Чтобы использовать эту идею при биохимических анализах, необходимо разработать общий подход, который бы позволял промывать сразу много образцов. [4]
Выделение и очистка ферментов, даже из доступного источника - работа весьма трудоемкая и требующая высокой квалификации, а изучение их специфичности ( знание которой, собственно, и обеспечивает столь высокую информативность ферментативного гидролиза) составляет сложную самостоятельную исследовательскую работу. Что же касается высоко очищенных ферментных препаратов, выпускаемых промышленностью, то многие из них исключительно дороги. [5]
Выделение и очистка ферментов представляют собой трудную задачу вследствие крайне низкого содержания ферментов в растительном и животном материале, а также их нестойкости и коллоидной природы. Среди известных методов получения в чистом виде ферментов большое значение имеет метод адсорбции. При соответственно подобранном рН адсорбция ферментов может происходить на трикальцийфосфате, гидроокиси алюминия, каолине и некоторых других адсорбентах. Адсорбированный фермент вытесняется буферным раствором. Адсорбция ферментов может проводиться в статических условиях, но часто оказывается удобным применять адсорбент в виде хроматографической колонки. [6]
Выделение и очистка фермента ДНК полимеразы из термофильных бактерий сопряжено со значительными сложностями, связанными прежде всего с высокой температурой выращивания этих бактерий. Решение проблемы заключалось в создании молекул рекомбинантной ДНК, несущих ген ДНК полимеразы из какой-либо термофильной бактерии, и получении на их основе штаммов-продуцентов термостабильных ДНК полимераз, экспрессирующихся в мезофильной бактерии кишечной палочки E. [7]
Этот способ очистки ферментов впервые был предложен А. [8]
Современные методы очистки ферментов от неорганических примесей, главным образом, от высаливающего сульфата аммония, а также от Сахаров и свободных аминокислот [1-3] основаны исключительно на диализе ферментных растворов через полупроницаемые ( например, целлофановые) мембраны. Этот процесс длителен, требует затраты большого количества воды и не дает хороших результатов. [9]
На конечных стадиях очистки ферментов часто используется электрофорез. Это - физический метод, в основе которого лежит различная скорость движения отдельных белков в электрическом поле, определяемая величиной свободного заряда их молекул. Так как количественные соотношения положительно и отрицательно заряженных групп в белках неодинаковы, то различия в их свободном ( суммарном) заряде могут служить основой для электрофоретического разделения белковых смесей. При различных рН среды он может двигаться либо к аноду, либо к катоду, причем с неодинаковой скоростью. [10]
Одним из методов очистки ферментов от растворимых низкомолекулярных примесей является диализ. [11]
В промышленности высокая степень очистки ферментов не всегда нужна. Очистка должна быть очень высокой в случае использования ферментов как терапевтических препаратов. [12]
Известно, что с повышением степени очистки фермента или иного белка его устойчивость обычно падает. Так как белки могут стабилизироваться другими белками ( часто балластными или примесями), поскольку их стабилизируют продукты реакции, коферменты, продукты распада белков или даже нейтральные соли, то при производстве ферментного препарата следует учитывать возникающие при их удалении опасности. Излишняя степень очистки почти всегда нежелательна. В каждом отдельном случае необходимо ясно представлять себе, в какой мере белок должен быть освобожден от примесей, не снизит ли это резко его устойчивости как при выделении, так и при хранении и использовании фермента в производстве. Кстати, высокая очистка обычно и сильно удорожает выпускаемый препарат. Несмотря на все эти замечания, еще раз подчеркиваем, что будущим в ферментной промышленности, как и в большинстве других областей использования ферментов, является, по-видимому, применение их чистых препаратов. [13]
В большинстве случаев при этом облегчены процессы очистки ферментов от примесей; обработка меньших объемов сырья технологически выгоднее. Таким образом, и в этом отношении использование биомассы микроорганизмов вполне оправдано. [14]
Подробное обсуждение этих реакций, а также описание очистки ферментов, участвующих в этих превращениях, приведены в обзоре Малера и в ряде оригинальных работ, где описаны химические и спектрофотометрические методы, применявшиеся при выделении ферментов и продуктов ферментативных реакций. Тем не менее относительно реакций представленных уравнениями ( 1) - ( 5), полезно сделать некоторые замечания. Будет достаточно привести описание очистки только одного из ферментов, поскольку методика является типичной, хотя она и не была одинаковой во всех случаях. [15]