Очистка - фермент
Cтраница 3
Чтобы выделить какой-то один специфический белок из смеси многих белков, нужно найти удобный способ определения концентрации этого белка, который бы контролировал каждую стадию разделения. Например, если мы ведем очистку фермента, то, измеряя его каталитическую активность, мы можем отличать его от всех других белков. [32]
Гораздо лучших результатов при получении самодельной закваски по нашемз мнению можно было бы достигнуть, применяя соскабливание с сычугов поверхностного ело или стирание его в сыром виде кристаллической поваренной солью, так как хотя фермент и находится в поверхностном слое, но он достаточно прочно удерживается на нем. Также полезно было бы применять очистку фермента по Гаммарстену путем смешивания снятого поверхностного слоя сычугов с поваренной солью, высушивания смеси и растворения ее в небольшом количестве воды. Отделение фильтрата освободило бы фермент от пептически действующих ферментативных примесей н позволило бы получать более чистый и более стойкий сычужный казеин. [33]
Препараты растительных и особенно микробных ферментов, выпускаемые промышленностью, обычно представляют собой смеси или комплексы катализаторов, различных ( или близких) по своим свойствам. Так как исследования по разделению и очистке ферментов сложны и трудоемки, отдельные представители до сих пор мало выделялись и не были подробно изучены. Сведения об их поведении и свойствах очень ограничены. [34]
Самнер был упорным и настойчивым человеком, он был вооружен убедительными доказательствами и не капитулировал перед авторитетами. Немного позднее эксперименты Нортропа и Кунитца по очистке ферментов подтвердили белковую природу биокатализаторов и Самнер был единодушно признан отцом современной энзимологии. Неоценимые заслуги в развитии этого направления связаны с именами дю Виньо, Сэнгера, Штайна, Мура, Перутца, Кендрью и Филлипса. Одновременно благодаря работам Чаргаффа, Уотсона, Крика и Уилкинса была выяснена структура дезоксирибонуклеиновой кислоты. [35]
Хотя попытки лечения при помощи сырых ферментных препаратов известны довольно давно, только в последние 10 - 15 лет ферментотерапия стала находить более широкое применение в медицине. Помогли этому достижения препаративной ферментологии в выделении и очистке ферментов, а также исследования их свойств и условий действия. Сейчас ферментные препараты используют во многих областях медицины: в хирургии, терапии, акушерстве и гинекологии, урологии, стоматологии, отоларингологии, при лечении кожных, глазных болезней, туберкулеза и многих других. [36]
Для выделения фермента из природных смесей ( или систем) его нужно отделить от небелковых веществ, причем в первую очередь от тех, которые могут соединяться с белком, а, кроме того, от разнообразных других белков, входящих в состав смеси. Степень трудности такого отделения, проводимого до желаемого уровня очистки фермента, может сильно варьировать, и хотя принципиальных затруднений может и не быть, но получить высокоочищенный препарат бывает очень трудно, а иногда ( в настоящее время. Специфическая функция фермента является как бы меткой, позволяющей различать его в сложной биологической смеси. Необходимо подчеркнуть, что рациональные способы и методы выделения ферментов могут быть разработаны только на основе изучения их физико-химических и биохимических свойств. По этому вопросу имеется значительная литература. [37]
Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что реакции синтеза переноса и арсенолиза катализируются одним и тем же ферментом. С этим выводом согласуется тот факт, что в ходе очистки фермента наблюдается параллельное повышение его активности в указанных трех реакциях и что при ультрацентрифугировании препаратов эти реакции оказываются связанными с одной и той же монодисперсной фракцией. Кроме того, оказалось, что эти реакции нуждаются примерно в одних и тех же нуклеотидах и ионах металлов. Описаны некоторые различия в действии ионов металлов, активаторов ( например, [ 3-меркаптоэтанола, цистеина) и ингибиторов ( например, фторида) на реакции синтеза и переноса, но это не может служить доказательством различия ферментов. [38]
Данные относительно действия высоких температур на пероксидазу разноречивы. Очевидно, устойчивость препаратов находится в тесной связи со степенью очистки фермента от разных примесей. Установлено, что одним нагреванием до кипения пероксидаза, как и фенолаза, еще не разрушается, так как через несколько часов вскипяченный раствор опять дает характерные реакции окисления. Пероксидаза разрушается окончательно только после вторичного кипячения. [39]
В настоящее время этот недостаток в основном преодолен благодаря значительному усовершенствованию методик очистки ферментов. [40]
Примененные методы выделения являются обычными для химии ферментов. Последующее центрифугирование при 3000 - 20 000 g дает надосадочную жидкость, используемую как источник сырого фермента. Очистка ферментов проводится путем осаждения СаС12, фракционирования сульфатом аммония, хроматографии на различных адсорбентах и др. При этом полного разделения дегидро-теназ обычно достичь не удается, но были получены препараты с резким преобладанием активности одного фермента. [41]
Поскольку этот фермент использует в качестве восстановителя виологен, можно ожидать, что донором электронов будет служить также ферредок-син. Далее было показано, что восстановленный пиридиннуклеотид не может служить в данном случае донором водорода; следовательно, исключено участие в этом процессе сопряженной системы переноса водорода от пиридиннуклео-тида к ферредоксину. При очистке фермента необходимо присутствие сульфгидрильных соединений, причем фермент чувствителен к цианиду и ацетату фенилртути. Следовательно, в функционировании фермента принимают участие SH-грушш и, возможно, ионы тяжелого металла. Фермент восстанавливает гидроксиламин, но со значительно меньшей скоростью, чем это свойственно общей реакции восстановления нитрита до аммиака. Это говорит о том, что в качестве промежуточного продукта в этой реакции не образуется свободный гидроксиламин. [42]
Шванну [20] впервые удалось обнаружить фермент животного происхождения - пепсин. Корвизар [21] исследовал трипсин, известный еще И. Е. Пуркинье и И. Первый успех в очистке ферментов был достигнут А. Я. Данилевским [24], разделившим в 1862 г. трипсин и амилазу поджелудочной железы путем адсорбции. [43]
Один из наиболее удобных методов изучения функций микроэлемента в ферментных реакциях основан на добавлении радиоизотопа элемента в питательный раствор. После этого выделяют и очищают ферментную систему и измеряют скорость катализируемой ферментом реакции. Если исследуемый элемент концентрируется при постепенной очистке фермента и не может быть удален из системы без потери каталитической активности, то почти наверняка элемент является необходимым компонентом ферментной системы, участвующей в реакции. Тогда, если сама реакция является необходимым этапом обмена веществ для нескольких видов растений и нет других возможных побочных путей, жизненная важность элемента является установленной. [44]
Большинство ферментов являются лабильными белками. При переводе их в экстракт они лишаются своего естественного ( в клетке) окружения и легко подвергаются денатурации и инактивации под влиянием различных факторов. В связи с этим при выделении и очистке ферментов необходимо соблюдать целый ряд предосторожностей. Как правило, все операции следует проводить при 2 - 4 С ( лучше - в холодной комнате), а фракционирование органическими растворителями - при температуре ниже 0 С. [45]
Страницы: 1 2 3 4