Cтраница 3
Позднее были предложены усовершенствованные методики разделения и очистки препаративных количеств а - и Р - МСГ ( [1925, 2199]; ср. Порат и Шэлли [1753] разработали метод разделения Ьуз8 - вазопрес-сина, окситоцина и а - и р - МСГ на сефадексе. [31]
Тот факт, что объем растворителя в неподвижной фазе, доступный для растворенного вещества, уменьшается при увеличении молекулярного веса последнего, позволил в ранних работах предложить простые геометрические теории ситового разделения. Согласно Порату, поры в неподвижной фазе имеют коническую форму, поэтому глубина, на которую могут проникнуть молекулы растворенного вешества, тем меньше, чем больше их радиус. Лаурент и Килландер / 6 / предложили более реалистическую модель; они допустили, что полимерные цепи, образующие матрицу неподвижной фазы, представляют собой хаотически распределенные жесткие стержни. Они использовали формулу, выведенную Огстоном / II, чтобы показать, как изменяется коэффициент распределения сферических молекул в зависимости от их радиуса, а также от концентрации стержней и радиусов последних. Порат, а также Лаурент и Килландер подтвердили свои модели экспериментально, но примененные критерии были, возможно, недостаточно чувствительны. [32]
Для полного разделения компонентов бацитрацина, входящих в обычные его препараты, с успехом применялся [3] хроматографический процесс на активированном угле с пониженной сорбционной емкостью. Как известно из ряда работ Тизелиуса и Порат [36-38], обработка адсорбента рядом веществ, приводящая к дезактивации поверхности, способствует повышению обратимости адсорбции и улучшает разделение веществ в хроматографи-ческом процессе. Для разделения компонентов, входящих в состав бацитрацина, применяется предварительная обработка активированного угля этилацетатом или гексанолом и уксусной кислотой. Элюция смесью, содержащей гексанол, уксусную кислоту и бутилацетат, приводит к более детальному разделению смеси, чем это может быть осуществлено противоточным методом в аппарате Крэга. [33]
Выделяющуюся щелочь титруют 0 1 М соляной кислотой на рН - стате. Для определения оксирановых групп в растворе Санберг и Порат [63] рекомендуют следующую методику. [34]
Гель-проникающая хроматография представляет собой разновидность метода фракционирования на колонке, в которой разделение осуществляется по принципу молекулярного сита. Этот принцип был известен уже в начале 50 - х годов, но лишь после того, как Порат и флодин [10] вновь открыли и широко использовали этот метод, он получил признание и широкое применение в научных исследованиях. Начиная с этого момента и до 1964 г. было опубликовано более 300 работ, посвященных этому новому методу фракционирования. [35]
В большинстве же случаев наблюдаемую задержку некоторых веществ при проведении гель-хроматографии [42, 43] называют обратимой адсорбцией. Порат [42], систематически исследовавший поведение аминокислот и их производных, пептидов и небольших белков, уже давно показал, что в слое геля, помимо гель-фильтрации, имеют место и иные явления, которые в значительной степени зависят от состава элюента. [36]
Только после того, как Порат и соавторы, а также Куатреказас и соавторы описали разработанную ими методику, число работ, в которых описывается разделение методом аффинной хроматографии, стало быстро расти. [37]
Неспецифическая сорбция является осложняющим фактором в аффинной хроматографии. Это уже неоднократно подчеркивалось и детально рассматривается в разд. Например, в агаре - одном из наиболее часто используемых носителей-как отмечают Порат и др. i [55], два типа групп ответственны за сорбцию, а именно моносульфатные эфирные и карбонильные группы. [38]
Преимуществом электрофореза в колонках является простота выделения разделенных зон при помощи обычных приемов элю-ирования, применяемых при хроматографии на колонках. Технические стороны этого метода были разработаны преимущественно в Институте биохимии в Упсале Хаглундом и Тизелиусом [31], Поратом [32], Флодином и Купке [33]; широко используется конструкция колонки, основанная на модели, описанной в 1957 г. Поратом [34] ( фиг. [39]
Преимуществом электрофореза в колонках является простота выделения разделенных зон при помощи обычных приемов элю-ирования, применяемых при хроматографии на колонках. Технические стороны этого метода были разработаны преимущественно в Институте биохимии в Упсале Хаглундом и Тизелиусом [31], Поратом [32], Флодином и Купке [33]; широко используется конструкция колонки, основанная на модели, описанной в 1957 г. Поратом [34] ( фиг. [40]
Оказалось, что низкомолекулярные соединения достаточно глубоко диффундируют в объем геля и по этой причине трудно вымываются подвижной фазой. Высокомолекулярные соединения или совсем не проникают в поры или, имея меньшую диффундирующую способность, проникают только в наиболее крупные поры. Порат и Флодин показали, что гель-проникающая хроматография может быть использована для удаления солей из видных растворов белков и для их концентрирования. В последние годы для гель-проникающей хроматографии предложено большое число насадок. [41]
В 1955 и 1956 гг. Лейт и Рутвен [3, 4] привели примеры, наглядно демонстрирующие те огромные возможности, которыми обладает набухший крахмал в отношении разделения пептидов и белков по размерам молекул. Первый коммерческий продукт - сефадекс ( декстран, сшитый эпихлоргидрином) - стал применяться после опубликования в 1959 г. работы Пората и Флодина [5], посвященной обессолива-нию и хроматографическому разделению низкомолекулярных соединений на гелях декстрана. [42]
Тот факт, что объем растворителя в неподвижной фазе, доступный для растворенного вещества, уменьшается при увеличении молекулярного веса последнего, позволил в ранних работах предложить простые геометрические теории ситового разделения. Согласно Порату, поры в неподвижной фазе имеют коническую форму, поэтому глубина, на которую могут проникнуть молекулы растворенного вешества, тем меньше, чем больше их радиус. Лаурент и Килландер / 6 / предложили более реалистическую модель; они допустили, что полимерные цепи, образующие матрицу неподвижной фазы, представляют собой хаотически распределенные жесткие стержни. Они использовали формулу, выведенную Огстоном / II, чтобы показать, как изменяется коэффициент распределения сферических молекул в зависимости от их радиуса, а также от концентрации стержней и радиусов последних. Порат, а также Лаурент и Килландер подтвердили свои модели экспериментально, но примененные критерии были, возможно, недостаточно чувствительны. [43]
На третьей стадии вносили образец, растворенный в буферном растворе с максимальным содержанием детергента; наконец, на четвертой стадии проводили элюирование также в буфере с максимальным содержанием детергента. Плохо растворимые в воде белки, смещаясь вдоль колонки, достигают зоны с критической концентрацией детергента, где выпадают в осадок. По мере увеличения содержания детергента в буферном растворе такие белки вновь переходят в раствор и мигрируют далее в зону с минимально возможной концентрацией детергента. В сущности этот метод аналогичен гель-хроматографии с зональным осаждением, разработанной Поратом [70] для разделения белков, обладающих различной растворимостью. В этом случае на колонке создают убывающий градиент ( снизу вверх) концентрации сульфата аммония, а затем вносят смесь белков. При элюирова-нии водой белки благодаря ситовому эффекту вначале обгоняют ионы сульфата аммония и при достижении зон с высокой концентрацией соли выпадают в осадок, В дальнейшем, постепенно растворяясь в разбавленном сульфате аммония, они смещаются со скоростью, соответствующей скорости изменения градиента. [44]
Полсон и Рассел [82] использовали для концентрирования стержень из органического стекла со спиральными канавками. На стержень надевают трубочку из целлофана, которую закрепляют по спирали нитью. В результате получают спиралеобразную трубку, одна стенка которой проницаема для воды. Этот диализатор помещают в более широкую трубку, в которую подают теплый воздух. В предложенной авторами схеме вентилятор включается автоматически при появлении пика на самописце детектора, Естественно, буферный раствор при этом также концентрируется; кроме того, возникает опасность тепловой денатурации лабильных белков. Согласно Порату и Бенниху [83], этих недостатков удается избежать, если поместить стержень с прикрепленной мембраной в осмотически активный концентрированный раствор поли - мера. [45]