Связывание - фермент
Cтраница 3
Шестичленные алифатические спейсеры не отличаются высокой степенью гидрофобности, и все же следует иметь в виду возможность различного рода нежелательных явлений, обусловленных такой гид-рофобностью. Например, известны случаи ложной биоспецифичности связывания фермента с аффинным сорбентом, когда попытки очистки на таком же сорбенте фермента с такой же биологической специфичностью, но полученного из другого объекта кончались полной неудачей. [31]
Ем кость по диазотированию носителя К - МДА составляет 0 24 - 0 26 мэкв. Носитель К - МДА используется преимущественно для связывания ферментов. [32]
Трудно определить заранее степень, до которой должен быть изменен заряд фермента, чтобы предотвратить его связывание на сорбенте. Максимальное число зарядов на аффинном лиганде, необходимое для предотвращения связывания фермента с ионооб. Поскольку наиболее эффективными аффинными лигандами для элюирования являются те, которые содержат заряженные группы, идентичные заряду ионообменника ( положительно заряженные группы в случае анионообмекников и отрицательные в случае катионообменников), было высказано предположение, что десорбция обусловлена различием в суммарном заряде на свободном ферменте и в заряде комплекса фермент - аффинный лиганд. [33]
Нуклеотиды lull вместе с нуклеотидами 0 образуют переходную гибридную область. В любой момент одновременно функционируют два рибонуклеозидтрифосфата; тем самым модель объясняет сильное связывание фермента. При перемещении фермента вдоль ДНК происходят конформационные изменения, способствующие реакции. Модель учитывает субъединичную структуру полимеразы. [34]
Из последнего соотношения видно влияние изменений Ль и L0 ня эффективность связывания фермента: их взаимная зависимость иллюстрируется рис. 3.3. Полученные кривые представляют собой прямоугольные гиперболы, подобные изотермам насыщения Ленг-мюра или уравнению Михаэлиса - Ментен. Из рис. 3.3, например, следует, что при обычной концентрации лиганда ( 10 ммоль / л) достаточно эффективное связывание фермента происходит при / Сь 10 - 3 моль / л, в то время как при более высоких значениях / ( L фермент удерживается плохо. [35]
Образование разветвлений идет совершенно иным путем - внутримолекулярным трансгликозилированием, приводящим к изомеризации исходного линейного полимера. Предполагаемый механизм его действия состоит во взаимодействии фермента с восстанавливающим концом цепи амилозы ( Л), разрыве гликозидной связи, расположенной на определенном расстоянии от места связывания фермента, и переносе полученной олигосахаридной цепи ( В) на соответствующий акцептор ( D) - амилозу, декстрин или уже предварительно разветвленный полисахарид. [36]
 |
Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры.| Зависимость скорости реакции от рН. [37] |
Ферменты крайне чувствительны к изменению концентрации водородных ионов. Это обусловлено такими причинами, как степень ионизации функциональных группировок, особенно в активном центре фермента, изменениями структуры белковой макромолекулы, а также влиянием рН на степень связывания фермента с субстратом. [38]
Если пространственная ножка еще более удлиняется, элюирова-ние может быть усилено ударным введением небольших количеств NADH. Связывание малатдегидрогеназы, о-глюкозо-6 - фосфатде-гидрогеназы и о-глицеральдегид-3 - фосфатдегидрогеназы значительно слабее TISM лзктатдегидпогеназы Чем не менее ля полимерных ножек с числом СН2 - групп п7 незаметно, чтобы связывание фермента существенно изменялось. Кроме того, из рис. 5.5 очевидно, что для связывания лактатдегидрогеназы на иммобилизованном нуклеотиде в пространственной группе необходимы по крайней мере четыре метиленовых звена. Установлено, что использование протяженной ножки длиной по крайней мере 0 5 нм достаточно, чтобы преодолеть барьер, воздвигаемый микро. Наличие такого барьера может быть обусловлено упорядоченным слоем молекул воды, окружающих скелет матрицы, и ограниченной диффузией в эту область или колебательными движениями решетки. В любом случае слой растворителя вблизи поверхности нерастворимого носителя представляет собой реальный барьер для взаимодействия макромолекулы с комплементарным аффинным лиган-дом, в особенности если взаимодействие проявляет слабую аффинность. [39]
Для характеристики ферментативных реакций обычно определяют оба параметра входящие в уравнение Михаэлиса - Ментен: максимальную скорость Vm и константу Михаэлиса Km - Важно отметить, что без детального знания механизма реакции интерпретация & кат Кт как констант связывания фермента субстратом и константы скорости превращения фермент-субстратного комплекса неправильна, поскольку для разных кинетических схем константы & Кат и Km могут отражать совершенно различные процессы ( см. табл. 1), тем не менее эти характеристики легко определяются экспериментально и в ряде случаев несут весьма важную информацию о свойствах каталитической реакции. [40]
Полученные препараты активированной сефарозы используют для иммобилизации НАД-зависимых дегидрогеназ. При данной степени активации тетрамерные молекулы глицеральдегид-3 - фосфатдегидроге-назы и лактатдегидрогеназы связываются с матрицей только через одну из субъединиц. Для связывания ферментов за несколько субъединиц и для получения иммуносорбентов препараты сефарозы активируют большим количеством BrCN: 50 - 250 мг на 1 г сефарозы. При высоких степенях активации предпочтительно использовать раствор BrCN в диоксане, а не в воде, так как в первом случае его растворимость значительно выше. [41]
АТР, белок сорбируется не только на интактной молекуле АТР, но также и на продуктах ее расщепления. Этот тип аффинной хроматографии на иммобилизованном субстрате в условиях, благоприятных для протекания ферментативной реакции, назван динамической аффинной хроматографией. Высказано также предположение, что связывание ферментов в этих условиях определяется скорее константой типа константы Ми-хаэлиса, а не константой ассоциации фермента с интактным субстратом. Динамические аффинные колонки, содержащие иммобилизованные субстраты, могут быть безусловно полезными для обнаружения изменений в связывающих участках активных центров ферментов и для разделения и выделения различных изофермен-тов. [42]
Кроме того, в книге приводятся сведения о ферментах, ковалентно связанных с нерастворимыми носителями, если эти ферменты использовались для аффинной хроматографии при выделении их ингибиторов или кофакторов либо при изучении механизма ферментативного действия или участия в метаболических путях. В ней также кратко изложены принципы аффинной хроматографии, которые необходимы для ее успешного использования, и последние достижения в этой области. Особое внимание в книге уделено нерастворимым носителям, применяемым как для аффинной хроматографии, так и для связывания ферментов, и использованию аффинной хроматографии для количественной оценки комплексообразования и влияния носителя. [43]
Учитывая эти данные, Морроу и др. [23] исследовали влияние ионной силы раствора на константу равновесия адсорбции и на константу скорости десорбции р-галактозидазы на сефарозе с присоединенным к ней бис - ( 3-аминопропил) амином. Около 90 % фермента, пропущенного через колонку, не задерживаются и только 10 % остаются связанными в колонке посредством электростатических связей и могут быть элюированы растворами с высокой ионной силой, например 1 М хлористым натрием. На основании этих результатов можно сделать вывод, что в данных условиях аминная часть ли-ганда мало участвует в связывании фермента. При хроматографии 3-галактозидазы в аналогичных условиях ( единственное отличие состояло в том, что к 0 05 М трис - НС1 - буферу не добавлялись соли) почти весь нанесенный фермент был неспецифически связан в колонке; 85 % фермента десорбировалось при увеличении ионной силы буферного раствора добавлением 1 М хлористого натрия. Очень хорошие результаты получались, если связывание ( 3-галактозидазы на замещенном геле проводилось при высокой ионной силе ( 1 8 М фосфатный буферный раствор), а последующее элюи-рование при помощи растворов с понижающимся линейным градиентом ионной силы. [44]
Сукцинат: убихинон-редуктаза ( СУР) катализирует окисление сукцината убихиноном. По данным электрофореза, в полиакриламид-ном геле в присутствии додецилсульфата натрия фермент состоит из 3 - - 4 полипептидов. Да) придают сукцинатдегидрогеназе реактивность по отношению к убихинону, чувствительность к специфическим ингибиторам и, по-видимому, принимают участие в связывании фермента с мембраной. Выделение препарата СУР основано на экстракции фермента из мембраны с помощью неионного детергента тритона Х-100 и концентрировании препарата охлажденным ацетоном. Дальнейшее фракционирование сульфатом аммония и очистка на кальций-фосфатном геле позволяют получить фермент в высокоочищенном состоянии с каталитической активностью около 25 мкмоль окисленного сукцината в 1 мин на 1 мг белка. [45]
Страницы: 1 2 3 4