Cтраница 4
Почти все ферменты крайне чувствительны к концентрации водородных ионов. Активность ферментов всегда уменьшается при изменении рН в любую сторону от некоторого ( оптимального) и сравнительно узкого интервала значений. Влияние рН определяется сочетанием трех факторов: 1) необратимыми изменениями структуры белка при экстремальных значениях рН, в том числе и изменением прочности и способа связывания ферментов с простетическими группами; 2) влиянием рН на степень ионизации субстрата и 3) влиянием рН на связывание субстрата с ферментом и на реакционную способность при катализе. Мы рассмотрим здесь только третий фактор. Что же касается первых двух, то их влияние можно определить независимо от самой реакции, кинетика которой исследуется, и на это влияние должны быть сделаны соответствующие поправки. [46]
Пока задача такого рода практически неразрешима и основные усилия сконцентрированы на разработке удобных и легких методов придания функциональности полимерным катализаторам. Примером может служить уже описанный твердофазный синтез пептидов. Фиксирование ферментов на полимерных носителях позволяет объединить возрастание функциональности с уменьшением энтропии. Методы связывания ферментов являются важной экспериментальной задачей, представляющей самостоятельный интерес. Ниже приводятся два примера, иллюстрирующие особенности обсуждаемой задачи. [47]
В качестве сорбентов - носителей ферментов часто используют гель гидроокиси алюминия или фосфата кальция, диатомит, модифицированный крахмал, бентониты, кизельгуры и др. Сорбцию ферментов осуществляют либо в колонках путем пропускания раствора фермента с определенной скоростью через слой ионитов, либо в реакторах, в которых сорбент определенное время перемешивают с раствором фермента. Полученный продукт затем используют как иммобилизованный ферментный препарат. Адсорбция фермента к носителю не обеспечивает их длительную стабилизацию. Более длительную стабилизацию обеспечивает ионообменное связывание фермента, например на модифицированных ионообменных целлюлозах. [48]
Соединение белковой и небелковой части сложных ферментов происходит при помощи водородных, гидрофобных или ионных связей. Гораздо реже встречается ковалентное связывание белкового компонента с простетической группой фермента. Коферменты или простети-ческие группы принимают непосредственное участие в процессе ферментативного катализа. Эти группировки определяют специфичность того или иного фермента, принимают участие в связывании фермента с субстратом, а также стабилизируют белковую часть фермента. [49]
Как показывает само название, сфинголипидозы вызываются дефектами ферментов катаболизма ( деградации) сфинголипи-дов. Такие дефекты приводят к накоплению липида или промежуточного продукта его деградации. Причинами этих наследственных заболеваний являются нарушения генетически контролируемого синтеза расщепляющих ферментов. Известен также по крайней мере один случай, когда болезнь обусловлена дефектом не самого фермента, а белкового фактора, активируемого гидролазой и облегчающего связывание фермента с его липофильным субстратом. [50]
На практике иммобилизация часто осуществляется одновременно иеск. Так, при фиксации ферментов ковалентными связями между их молекулами н матрицей обычно возникают также нековалентные взаимодействия. Известны способы предварит, хим. модификации молекул фермента низкомол. При всех типах иммобилизации матрица, взаимодействуя с ферментом, может инактивировать последний или создавать пространств, затруднения для доступа субстрата к активному центру. При ковалентиом связывании фермента для предотвращения отрицат. Кроме того, часто стремятся использовать для иммобилизации гидрофильные матрицы, создающие вблизи фермента более естеств. [51]
Совсем недавно был разработан другой столь же мощный метод, связанный с нитроксидными спиновыми метками. Он основан на использовании влияния, которое парамагнитный нитроксид оказывает на ЯМР-спектр биологической структуры. В данном случае радикал уменьшает времена релаксации и тем самым уширяет линии резонанса близко расположенных магнитных ядер. Результаты измерения времен спин-решеточной и спин-спиновой релаксации в сочетании с измерением времен корреляции позволяет рассчитывать расстояние, которое отделяет не-спаренный электрон от возбуждаемого ядра. На этой основе возникает эффективный способ исследования геометрии центра связывания фермента. [52]
Когда химическая реакция протекает в растворе, катализатор и молекулы субстрата должны тесно сблизиться, что приводит к большому уменьшению энтропии. Однако можно считать, что для понимания химизма ферментативной реакции можно ограничиться изучением ферментсубстратного комплекса, в котором каталитические группы кооперативно действуют на одну и ту же молекулу. Таким образом, в переходном состоянии отсутствует потеря поступательной и / или вращательной энтропии. Из этого следует, что эффективная концентрация ка-групп фермента очень высока по сравнению с би-реакциями в растворе, что приводит к выигрышу энтропии, который компенсируется энергией связывания фермента с субстратом. [53]
Аффинная хроматография [27-31] i представляет собой один из наиболее специфических методов выделения реакцион-носпособных соединений, в частности ферментов, и даже таких надмолекулярных агрегатов, как вирусы. Сорбентом в этом случае служит гель типа агарозы, к которому ковалентно присоединен подходящий лиганд, например субстрат фермента. Когда раствор, содержащий выделяемое вещество ( скажем, фермент), пропускают через колонку с соответствующим образом приготовленным сорбентом, взаимодействие этого вещества с закрепленным на сорбенте лигандом ( в данном случае фермента с субстратом) приводит к его удерживанию и, следовательно, к концентрированию. Поскольку сорбция носит обратимый характер, это вещество можно затем элюировать с колонки. Один из вариантов этого приема, который, строго говоря, уже не относится к области хроматографии, заключается в том, что иммобилизованный на геле фермент служит для непрерывного превращения растворенного в подвижной фазе субстрата. Разделение по методу аффинной хроматографии может быть основано на различного рода специфических взаимодействиях, таких, как связывание фермента с ингибитором, гормона с рецептором, антигена с антителом, а также гибридизация полину-клеотидов. Этот метод позволяет выделять даже целые клетки. [54]
Детальное рассмотрение всех этих исследований увело бы нас слишком в сторону. Активность фермента, как правило, зависит от целостности его третичной структуры. Под действием денатурирующих агентов, изменяющих конформацию фермента, его активность либо уменьшается, либо исчезает полностью. По меньшей мере в одном случае - для рибонуклеазы - установлено, что связывание фермента с субстратом способствует сохранению его конформации даже в присутствии агентов, которые в отсутствие субстрата вызывают денатурацию. Вместе с тем не вся первичная структура необходима для обеспечения активности. Например, фермент папаин, по своим свойствам подобный протеолитическим ферментам, сохраняет свою активность при отщеплении 3 / 5 его молекулы. Активный фрагмент папаина сохраняет чувствительность к действию денатурирующих агентов, и это свидетельствует о том, что для обеспечения активности необходима определенная третичная структура. В свете этих данных возникает вопрос: почему молекулы ферментов так велики. [55]
В некоторых случаях обнаружено, что при использовании свежеприготовленных сорбентов теряется часть активности выделяемого вещества, вероятно, из-за его необратимой сорбции. Так, Го-рецкий и др. [12] описали изменчивость конъюгата пенициллин - сефароза. Аминобензилпенициллин, присоединенный к сефарозе брО Мциановым методом, дает очень устойчивый конъюгат, который сохраняет свою способность специфически адсорбировать D-ала-нинкарбоксипептидазу даже после хранения в воде в присутствии 0 02 % азида натрия при 4 С в течение нескольких месяцев. Насыщение геля неочищенным ферментом ( для чего берется - 10-кратный избыток фермента по сравнению с используемым для обычной очистки) превращает пенициллин-сефарозу в нормальный обратимый сорбент, пригодный для аффинной хроматографии D-аланинкарбоксипептидазы. Этот эффект насыщения высоко специфичен, и никакой другой инертный белок, например бычий сывороточный альбумин, не может заменить D-аланинкарбок-сипептидазу в необратимой сорбции. Кроме того, показано, что при хранении гелей при 4 С некоторые из них, характеризующиеся необратимой сорбцией, превращались в сорбенты, пригодные для нормальной аффинной хроматографии. Это можно объяснить уменьшением числа высокоактивных сорбирующих центров на поверхности геля, вследствие чего связывание фермента этими модифицированными специфическими сорбентами становится обратимым. [56]