Cтраница 4
При полном гидролизе фрагмента А8, содержащего этот участок, под действием гуанил - РНК-азы были обнаружены помимо продуктов гидролиза А7 два три-нуклеотида, содержащие дигидроуридиловую кислоту ( Б9 и Б10), динуклеотид CpGp ( Б11) и гуанозин - З - фосфат. Присутствие в продуктах расщепления тРНК пиримидил - РНК-азой тринуклеотида ApGpCp ( B7) позволяет считать, что фрагменты Б10 и БИ соединены между собой. [46]
Аналогичные результаты были получены при обработке смеси М 3 - О-диацетил ( или дибензоил) дезоксиаденозин-5 - фосфата и N-бензоилдезоксиаденозин - 5 -фосфата дициклогексилкарбодиимидом, за исключением того, что не был выделен ни один циклический динуклеотид и вместо него основным продуктом был циклический тринуклеотид. [47]
В этом смысле мононуклеотиды и динуклеотиды резко различаются: конформационная свобода первых очень велика благодаря возможности вращения вокруг пяти одинарных связей рибо-зофосфатного скелета и гликозидной связи между основанием и фуранозным кольцом; в то же время в динуклеотидах конформационная свобода ограничена из-за стремления оснований расположиться одно под другим. По этой причине рассмотрение возможных конформации наименьших структурных единиц полинуклеотидов ( фрагментов, не превышающих по величине мононуклеотид) еще не приводит к полному пониманию конформации макромолекул. [48]
В этом смысле мононуклеотиды и динуклеотиды резко различаются: конформационная свобода первых очень велика, благодаря возможности вращения вокруг пяти одинарных связей фосфорно-эфирного скелета и гликозидной связи между основанием и фуранозным кольцом; в то же время в динуклеотидах конформационная свобода ограничена из-за стремления оснований расположиться одно под другим. По этой причине следует рассмотреть отдельно конформации моно - и динуклеотидов, и тогда закономерности, найденные для динуклеотидов, легко могут быть распространены на однотяжевые поли-нуклцотиды. [49]
В случае высокоочищенных ферментных препаратов полимеризация происходит лишь после индукционного периода, которого, однако, можно избежать при добавлении небольшого количества полину-клеотидиой или олигонуклеотидной затравки ( природной, а также синтезированной ферментативным или химическим путем), включая даже динуклеотиды. Полимерные цепи образуются в результате последовательного присоединения мононуклеотидов к неэтерифици-рованной З - гидроксильной группе концевого нуклеозидного остатка; затравки, содержащие свободную З - гидроксильную группу, такие, как ф5 АЗ ф5 А или АЗ ф5 У, при этом включаются в поли-нуклеотид. Полимеризация гуанозин-5 - пирофосфата требует обязательного наличия такой затравки. При этом индукционного периода не наблюдается, хотя эти олигонуклеотиды не включаются в конечный полимерный продукт. При действии ферментов в противоположном направлении полинуклеотиды легко фосфоролизируются с образованием нуклео-зид-5 - пирофосфатов. Так, ферментативно синтезированные гомополимеры быстро фосфоролизируются так же, как и небольшие олигонуклеотиды, содержащие концевой 5 -фосфат, в то время как фосфоролиз олигонуклеотидов ( вплоть до пентануклеотидов) с концевой З - фос-фатной группой не идет. Как и в случае синтеза, реакция фосфоролиза идет ступенчато ( начиная от конца, несущего неэтерифициро-ванную З - гидроксильную группу), причем конечным продуктом являются нуклеозид-5 - пирофосфаты и концевой динуклеотид. Фосфоролиз многотяжных цепей ( таких, как смесь полиадениловой и полиуридиловой кислот) и сополимеров в значительной степени затруднен. Относительное увеличение скорости фосфоролиза препаратов рибонуклеиновых кислот при повышении температуры связано с температурным гиперхромным эффектом полинуклеоти-дов. Поскольку этот тип гиперхромного эффекта может рассматриваться как результат ( косвенный) расщепления водородных связей, фосфоролиз, таким образом, зависит в значительной степени от конформации полинуклеотида и, в особенности, от количества водородных связей. Оказалось также, что полинуклеотидфосфорилаза катализирует перенос нуклеозидмонофосфатных единиц от поли-нуклеотида-донора к другому акцепторному полинуклеотиду. [50]
Например, тринуклеотиды фУфУфУ, фАфАфА и фЦфЦфЦ направляют присоединение фенилаланин -, лизин - и пролин - s - PHK соответственно. Динуклеотиды не оказывают никакого действия. [51]
Метод иллюстрируется здесь ссылкой на один из трех синтезов самокомплиментарных декамерных фрагментов ДНК, которые, в форме дуплексов, являются субстратами для расщепления ферментами рестрикции [7] ( см. разд. Динуклеотид dCpCp защищен с помощью 4-хлорфенола по фосфатным группам, бензоильными остатками - по основаниям и диметокситрити-лированием-по 5 -гидроксильной группе. Затем эти пентамеры сшивают, что приводит к декамерному соединению, которое после удаления всех защитных групп аммиакатом пиридиния и последующей мягкой кислотной обработки было очищено тонкослойной хроматографией на целлюлозе. [52]
Самые простейшие нуклеиновые кислоты - моно-нуклеотиды; такая нуклеиновая кислота представляет собой просто тот или иной нуклеотид. Следующей ступенью усложнения являются динуклеотиды, молекулы которых состоят из двух нуклеотидов, соединенных друг с другом. С нарастанием количества нуклеотидов мы будем соответственно иметь три -, тетра -, пента -, и, наконец, полинуклеотиды, молекулы которых слагаются из десятков, сотен и даже тысяч отдельных нуклеотидов. [53]
Молекулярный вес желтого фермента равен примерно 80 000 [142], и каждая молекула фермента содержит 1 молекулу флавинадениндинуклеотида. Весьма вероятно, что динуклеотид соединяется с основными группами белкового компонента посредством фосфорной кислоты. [54]