Инкубационная смесь
Cтраница 3
Из инкубационной смеси сразу же после погружения пробирок в термостат, а также через каждые 30 мин отбирают по 0 1 мл, выливают в мерные пробирки и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин. Добавляют воду до 1 мл, перемешивают и центрифугируют. Осадок отбрасывают, а центрифугат ( или часть его) переносят в спектрофотометрическую кювету, содержащую все необходимые компоненты для определения транскетолазной активности ( с. Скорость транскетолазной реакции в данном случае должна лимитироваться количеством ксилулозо-5 - фосфата, образовавшимся в инкубационной смеси и добавляемым в спектрофотометрическую кювету в составе центрифугата. [31]
В двух пробирках готовят Инкубационные смеси, как указано в таблице. [32]
Метод основан на количественном определении уксусной кислоты, образующейся из ацетилхолинхлорида в ферментативной реакции, катализируемой холинэсте-разой сыворотки. Уксусная кислота сдвигает рН инкубационной смеси, что выявляется с помощью индикатора и количественно определяется колориметрическим методом. [33]
При исследовании крови смешивают 1 мл образца с 9 мл 10 % - ной ( масс. / об.) трихлоро-уксусной кислоты; раствор центрифугируют или фильтруют. В случае тканевых экстрактов, инкубационных смесей ферментов и других объектов обычно достаточно создания в конечном растворе концентрации трихлороуксусной кислоты 3 - н 5 % ( масс. / об.) для обеспечения полного осаждения белков. Небелковый азот остается в супернатанте. [34]
В двух пробирках ( опытная и контрольная) готовят инкубационные смеси, как указано в таблице, соблюдая последовательность добавления реактивов. [35]
При низких концентрациях мальтозы это показано путем измерения редукции инкубационных смесей, а при высоких - методом хроматографии на бумаге. [36]
Пробирки с реакционной смесью вынимают изо льда и помещают в водяной термостат при 37 С. Через 5, 10, 15 и 20 мин отбирают из инкубационной смеси по 0 1 мл и переносят в пробирки, содержащие по 0 4 мл 5 % - ной трихлоруксусной кислоты. [37]
Как изменится концентрация лактата ( увеличится, уменьшится, не изменится) при добавлении в эту инкубационную смесь высоких концентраций следующих веществ: а) АМФ; б) АТФ; в) цитрат; г) ацетил - КрА; д) НАДН; е) малонат. [38]
В этом случае в качестве матрицы для синтеза была использована природная однони-тевая ДНК фага. С помощью ферментативной реакции получен двухспиральный комплекс, вновь синтезированная цепь которого содержала вместо остатков тимидина остатки 5-бром - 2 -дезокси-уридина, поскольку в инкубационной смеси тимидин-5 - трифосфат был заменен на 5-бром - 2 -дезоксиуридин - 5 -трифосфат. Комплементарные полинуклеотиды разделялись центрифугированием в градиенте плотности, и биосинтетический полинуклеотид вновь использовался как матрица в ферментативной реакции. [39]
Что касается энзиматического распада ИУК с участием марганца, то по этому вопросу имеется большое число данных. Еще до появления работ Галстона и сотрудников, показавших, что разрушение ИУК оксидазным препаратом, выделенным из проростков гороха, резко усиливается, если в инкубационную смесь вводить ион марганца, Кентен и Манн ( Kenten, Mann, 1949; Kenten, 1951) высказали интересные соображения о значении марганца в деятельности ауксиноксидазы. Они предложили схему работы ИУК-оксидазы, в основе которой лежит предположение, что реакция есть цепь аутоокислительных процессов, проходящих при участии двух пероксидаз, одна из которых окисляет Мп до Мп, другая - образует окончательный продукт окисления из индолпероксида и фенольного кофактора. [40]
 |
Зависимость концентрации мочевины of. времени Инкубации с ферментом. [41] |
В четвертую пробирку ( контрольная) наливают 2 мл раствора ТХУ. Затем во все четыре пробирки наливают по 0 4 мл ферментного препарата, по 1 4 мл глицинового буфера ( рН 9 5) и по 0 2 мл раствора аргинина. Инкубационные смеси тщательно перемешивают. [42]
Гибридизацию исследуемой ДНК-ДНК, иммобилизированной на фильтре, проводят в 1 5 - 2 мл раствора 2XSSC в бюксах диаметром 2 5 см и высотой 4 см, снабженных пришлифованными крышками. В бюкс с 1 5 - 2 0 мл 2XSSC опускают нитроцеллюлозиый фильтр с иммобилизированной в нем ДНК, добавляют денатурированную реперную ДНК ( в количестве до 100 у) - Смесь инкубируют при 60 - 65 в течение 16 - 18 часов. Затем инкубационную смесь медленно охлаждают. [43]
Гомогенат фильтровали через четыре слоя марли, в фильтрате определяли активность фермента. Состав инкубационной смеси: 4 мг дрожжевой РНК, 0 4 мМ КС1, 1 мл гомогената и ацетатный буфер ( рН 5 8); конечный объем 2 5 мл. Пробирки погружали в снег на 10 мин. [44]
Из этой же инкубационной смеси была выделена гшс-аконитовая кислота, которая, как и ожидалось, не обладала заметной радиоактивностью. Затем тритированная лимонная кислота инкубировалась с аконитазой, НАДФ и избытком изоцитратдегидро-геназы [ следующим фермент никла, см. схему ( 4 - 2) ] до тех пор, пока восстановление НАДФ не заканчивалось полностью. Это называет на то, что, по крайней мере, это количество лимонной кислоты превратилось в пзолимонную, минуя стадию промежуточного образования свободной ш / с-аконнтовой кислоты и воды. Стереохимическое рассмотрение позволяет предположить, что перенос водорода ( трития) между а - и р-углсродамн, необходимый для осуществления наблюдаемого превращения, происходит путем переноса подвижного водорода в виде протона между ферментом и лимонной и изолимонпон кислотами, выступающими в качестве субстратов. Внутримолекулярный цмс-гид-рндный перенос не приводит к нужным конфигурациям кислот. [45]
Страницы: 1 2 3 4