Аффинный сорбент

Cтраница 2

При синтезе аффинного сорбента ( если считать, что все его компоненты выбраны обоснованно) перед экспериментатором встают практические вопросы количественных соотношений, и в первую очередь задача выбора оптимальной концентрации ( плотности пространственного расположения) лиганда на матрице. Для этого в описанных выше процедурах посадки лиганда он может варьировать соотношения количеств лиганда и матрицы, а также условия реакции, в частности ее продолжительность. Хотя подбор оптимальной концентрации лиганда в конце концов ведется эмпирически, имеет смысл провести некоторое общее рассмотрение этого вопроса, с тем чтобы прояснить хотя бы порядки величин, с которых следует начинать такой подбор в каждом конкретном случае. [16]

Важной группой аффинных сорбентов являются иммобилизованные антитела, или антигены. В первом случае сорбенты могут быть использованы для специфического выделения определенных антигенов, или галтенов, из сложных смесей. В этом случае эти сорбенты называют иммуносорбентами. Во втором случае иммобилизованные антигены способствуют выделению антител с определенной специфичностью из сложной смеси антител. [17]

Фирма Bio-Rad выпускает готовые аффинные сорбенты ( типа Affi-Gel) на основе как обычной, так и химически сшитой агарозы. В подавляющем большинстве готовых аффинных сорбентов фирм PL-biochemicals, Sigma и Pierce ( кроме Agarose-Blue) используется несшитый 4 % - ный гель агарозы. Фирмы LKB ( Швеция) и IBF ( Франция) также используют в качестве матриц обычную и химически сшитую агарозу под названиями Ultrogel А и Ultrogel AR соответственно. Они ( особенно IBF) широко используют смешанные матрицы типов Ultrogel АсА 22 и Ultrogel АсА 34 с посадкой лигандов по амидным группам акриламида. Напомним, что первая цифра в этих наименованиях означает процентное содержание акрпламида, а вторая - агарозы. [18]

Вообще тщательную промывку аффинного сорбента перед его использованием, а особенно после длительного хранения следует предусмотреть в любом варианте аффинной хроматографии. Это явление опасно не уменьшением емкости сорбента ( на доли процента), а тем, что перешедшие в раствор молекулы лиганда могут оказаться на два-три порядка более активными в отношении связывания вещества, чем иммобилизованные молекулы. Это создает ситуацию конкурентной элюции в тот момент, когда должна происходить посадка вещества на сорбент. Результатом такой ситуации может оказаться заметное уменьшение и даже полное отсутствие задержания вещества на сорбенте. Подтекание лигандов может происходить не только за счет отрыва их ковалентно связанных молекул от матрицы, но и в результате постененной десорбции тех молекул лиганда, которые не были отмыты после посадки его на матрицу. [19]

Материалы для получения аффинных сорбентов приведены структуры некоторых широко используемых спейсеров и показаны способы их закрепления на матрице; приведены также концевые реакционноспособные группы, с помощью которых ковалентно присоединяется лиганд. [20]

Рейсе и Сэндквист готовили аффинный сорбент, содержащий краситель Cibacron Blue F3GA, использовав для этой цели продажный препарат голубого декстрана фирмы Pharmacia, в котором краситель связан с декстраном через остаток триазпнтрихлорида. BrCN-активированной сефарозы вымачивали 20 мин в 1 мМ НС1 и промывали 10 раз по 300 мл того же раствора на стеклянном фильтре. Затем гель вносили в 50 мл 0 4 М Na2C03 ( рН 10), где был предварительно растворен 1 г голубого декстрана, перемешивали 2 ч при комнатной температуре, затем отмывали избыток декстрана на фильтре и для блокирования свободных активных групп имидокарбоната переносили гель в 0 2 М Трис-HCl ( рН 8), где перемешивали 2 ч с одной сменой буфера. [21]

Простое ycipoitcTBO для десорбции вещества с аффинного сорбента методом электрофореза [ Morgan et al., 1979 ]. [22]

Иногда десорбция вещества с аффинного сорбента идет с трудом, препарат сильно разбавляется и [ имеется опасность его денатурации. [23]

Выход фермента при элюировании растворимым ингибитором. Сплошные линии - V. ч 10, пунктирные - V. о1. Без стадий промывки. Соотношение объемов элюирования сильно влияет на общий выход фермента, который может быть достигнут. [24]

На элюировании фермента с аффинного сорбента растворами растворимого ингибитора в различных концентрациях основан наиболее распространенный в настоящее время метод определения констант равновесия выделяемого со связанного ингибитора фермента. Практические примеры применения этого метода детально рассмотрены в гл. [25]

Целью работы было создание нового аффинного сорбента с иммобилизованной л-аминофенилбороновой кислотой ( л - АФБК) на основе широко применяемого в биохимии полиакриламидного геля ( ПААГ) для определения гликолизированного гемоглобина в крови человека. [26]

Во втором случае на аффинном сорбенте должны быть закреплены вполне определенные участки генома. [27]

По-видимому, хорошими матрицами для аффинных сорбентов могут служить гидрофильные оксиалкилметакрилатные гели, выпускаемые в США и Чехословакии под названием сфероны. Их гидро-ксильные группы по своим свойствам аналогичны гндроксилам ага-розы. По ним может идти активация бромцианом. Сами матрицы достаточно жестки, химически стойки, не атакуются микроорганизмами. [28]

Недавно фирма Pierce начала выпуск аффинного сорбента для очистки гликопротеидов под названием Glyco-Gel В, в котором борная кислота закреплена непосредственно на матрице 6 % - ной агарозы. [29]

В одноразовом методе сорбции на аффинном сорбенте играет важную роль концентрация фермента в исходном растворе. Такая же зависимость обнаруживается и на рис. 5.3, где приведены теоретические и экспериментальные данные для содержания комплекса фермент - иммобилизованный лиганд на аффинных сорбентах с различной концентрацией лиганда. [30]

Страницы: 1 2 3 4