Cтраница 4
Другие фирмы ( PL-biochemicals, Bio-Rad, Pierce) выпускают аналогичные аффинные сорбенты на основе полиакриламида. В этом случае не возникает проблем с анионообменными свойствами, но использование таких сорбентов для очистки нуклеиновых кислот ограничено меньшим размером пор. Недавно было описано получение фенилборильных сорбентов на основе агарозы. Однако, судя по их данным, им не удалось надежно избавиться от неспецифической сорбции - на этот раз, по-видимому, за счет незамещенных карбоксильных групп исходного ионообменника. [46]
В литературе неоднократно описывались попытки использовать в качестве матрицы для аффинных сорбентов пористое стекло [ Wee-tall, Filbert, 1974; Weetall, 1976 ], однако они не имели успеха ввиду высокой неспецпфнческой адсорбции на стекле. Недавно было предложено использовать для той же цели крупнопористый силикагель. Отмеченный в предыдущих главах низкий уровень неспецифнческой сорбции на снликагеле наряду с его идеальной жесткостью, хорошо разработанной технологией приготовления мелкозернистых и крупнопористых гранул открывает, по-видимому, интересные перспективы для аффинной хроматографии. [47]
Из сопоставления ВЭТТ можно сделать важные практические выводы, а именно найти аффинный сорбент, характеризующийся не только хорошей связываемостью, но и лучшей избирательностью. Очевидно, таким образом Олсон и др. [28] обнаружили, что необходимо прекратить поток раствора в колонке за несколько часов перед специфическим элюированием. Этот факт можно использовать для хранения ферментов, устойчивость которых зависит от присутствия субстратов или кофакторов. [48]
Кстати, следует отмстить, что оптимальное с точки зрения посадки на аффинный сорбент значение рН буфера вовсе не обязательно должно совпадать с рН011т для самой реакции ферментативного катализа. [49]
Наконец, если такого сорбента нет, то приходится решать проблему создания аффинного сорбента с индивидуальной специфичностью: выбирать-лиганд, матрицу, способ иммобилизации лиганда на матрице и способ элюции. Обоснования общего характера для такого выбора были подробно рассмотрены выше, но, конечно, в каждом частном случае1 могут возникнуть своп специфические проблемы. Хроматографи-ческуго очистку па аффинном сорбенте с индивидуальной специфичностью, как правило, удается нести в статическом варианте хро-матографшт. [50]
Поэтому мы начнем изложение с краткой характеристики используемых в настоящее время компонентов аффинных сорбентов: матриц, лигандов и спейсеров. Одновременно рассмотрим способы соединения их между собой, ограничившись только теми немногимп пз большого числа вариантов, испробованных и описанных в прошлом десятилетии, которые выдержали проверку временем. Впрочем, к ним имеет смысл добавить два-три только что предложенных способа, обещающих какие-то новые преимущества. Затем можно будет проанализировать более подробно параметры и характерные особенности процесса аффинной хроматографии и на основании этого анализа сформулировать некоторые рекомендации по практической постановке эксперимента. [51]
На практике нередко возникает такая ситуация, когда уже готовая колонка с аффинным сорбентом оказывается загруженной лишь на малую долю своей эффективной емкости. Весь препарат в этом случае сорбируется в верхнем тонком слое сорбента. Для динамического хроматографического фракционирования это хорошо, но в обычном варианте статической аффинной хроматографии такая ситуация невыгодна уже тем, что в процессе элюции, продвигаясь по всей длине колонки, полоса очищенного вещества будет расширяться хотя бы за счет продольной диффузии в элюенте. Проблема легко разрешается - перед началом элюции снабженную адаптером колонку следует перевернуть и элюировать обратным током жидкости. [52]
Фирмы Pierce и Amicon, кроме сорбента на основе Cibacron Blue, выпускают также агарозные аффинные сорбенты с красным красителем Procion Red HE3B, специфическое отличие которого было отмечен выше. [53]
Как уже упоминалось, ковалентная посадка НК на матрицу может оказаться непригодной для создания аффинного сорбента с индивидуальной специфичностью, поскольку многие основания поли-нуклеотидной цепи будут заблокированы химической связью с носителем. По этой причине широкой популярностью пользуются различные методы нековалентной фиксации НК на матрицах. Исторически они были разработаны значительно раньше, но до сих пор не утратили своего значения. Около половины внесенных в расплавленный агар молекул ДНК после его затвердевания оказываются столь надежно запутанными в сеть геля, что не выходят из него даже цосле длительной промывки. [54]
Мы столь подробно разобрали и проиллюстрировали методику использования BrCN-активированной сефарозы, потому что этот вариант приготовления аффинных сорбентов в настоящее время пользуется наибольшей популярностью. Теперь рассмотрим ( менее детально) способы использования других готовых активированных матриц. [55]
Впрочем, иногда в препаративных опытах имеет смысл примириться с некоторыми потерями вещества в интересах более полного использования аффинного сорбента, а также с заметным разбавлением вещества, если имеется возможность последующего его концентрирования. [56]