Неспецифическая сорбция

Cтраница 2

Эффективность аффинной хроматографии снижается в основном из-за неспецифической сорбции инертных веществ. Неспецифические эффекты, как правило, очень слабы и проявляются главным образом во взаимодействующих системах с низким сродством. [16]

Этот сорбент характеризуется высокой концентрацией ДНК, и неспецифическая сорбция на нем может быть сведена до минимума выбором подходящих условий. На рис. 10.9 приведен пример использования ДНК - агарозы для выделения РНК-полиме-разы. В очень многих реакциях, катализируемых ферментами, функцию косубстратов выполняют коферменты. [17]

Схема биоспецифической адсорбции ( А, элюирования деформирующим буферным раствором ( 5 и биоэлюирования растворимым конкурентным лигандом ( В. [18]

На подложках с гидрофобными или ионогенными группами часто наблюдалась неспецифическая сорбция. [19]

Имеется ли опасность агрегации, выпадения в осадок, неспецифической сорбции веществ на материале матрицы. Следует ли вводить в элюент какие-либо добавки, препятствующие развитию этих явлений, например мочевину, соль, детергенты или органические растворители. [20]

В синтетических полимерах, например оксиалкилметакрилатных телях типа сферона, неспецифическая сорбция может быть обусловлена остающимся неэлюированным органическим растворителем, который использовался при приготовлении сорбента. [21]

Радиоактивность, оставшаяся на фильтрах, соответствует фону РНК ( неспецифическая сорбция) ( см. разд. Допустимый фон составляет 0 01 % от радиоактивности исходной РНК или 10 % от предполагаемой радиоактивности гибрида. [22]

Какие из препятствующих молекулярному взаимодействию агентов действительно нужны для подавления неспецифической сорбции - в каждом конкретном случае решает эксперимент. Использование для страховки всех возможных средств подавления сорбции неразумно. Дело в том, что неспецифическая сорбция может и помогать аффинному взаимодействию. Так, можно себе представить механизм, по которому и само нужное вещество сначала лабильно связываетс-i с лигандом или его спейсером за счет неспецифического гидрофобного взаимодействия, а потом, изменив свою ориентацию в пространстве, нащупывает и биоспецифическое взаимодействие, возникающее при сближении участков взаимного узнавания на поверхностях вещества и лиганда. [23]

Белковые экстракты из яиц или ядер куколок дрозофилы во избежание неспецифической сорбции смешивали с фрагментирован-ной нативной ДНК тимуса и пропускали через колонку, заполненную описанным аффинным сорбентом в буфере следующего состава: 0 025 М NaCl 0 01 М Трио-IICl ( рН 7 4) 5 мМ р-меркаптоэта-нола 5 мМ Mg-ацетата 10 % глицерина. Колонку промывали тем же буфером, а затем элюировали в три этапа, подавая последовательно по 20 объемов колонки 2 М NaCl, 2 М NaCl с 6 М мочевиной и 0 5 % - иого раствора ДДС-Na в том же буфере. Наличие нужного белка в элюате устанавливали путем гибридизации на фильтре с радиоактивно меченной ДНК плазмид. [24]

Отличие было лишь в том, что для насыщения мест неспецифической сорбции в буфер для предварительной промывки колонки вместо БСА вводили 0 5 мг / мл дрожжевой тРНК и 1 % глицина, а детергенты не вводили. В буфере для гибридизации концентрация NaCl была увеличена до 1 М и наряду с тРНК ( 50 мкг / мл) присутствовало 0 2 % ДДС-Na, а поливинилпирролидон и фиколл отсутствовали. [25]

Однако, если сефароза не блокирована тотчас же после активации, наблюдается неспецифическая сорбция белков, которая становится тем сильнее, чем больше проходит времени между активацией бромцианом и блокированием активных центров. Препарат человеческий сывороточный альбумин-сефароза, блокированный после 12 ч после присоединения сывороточного альбумина, сорбирует только 0 4 мг белка на 1 мл геля. [26]

Этот выбор диктуется в основном стремлением сохранить натив-ность очищаемого белка и максимально уменьшить неспецифическую сорбцию других компонентов исходной смеси. Само аффинное связывание вещества с лигандом, как правило, от состава буфера жидкой фазы зависит мало. Интересами сохранения нативности и растворимости белка диктуются выбор рН, наличие соли, а иногда ( например, для белков мебран) введение в буфер добавок органических растворителей или детергентов. Все это определяется известными свойствами данного белка. Неспецифическая сорбция примесей, в частности балластных белков, на матрице и спейсерах происходит за счет тех же самых сил ( притяжения разноименно заряженных групп, водородных связей и гидрофобных взаимодействий), которые обусловливают и биоспецифическое связывание вещества с лигаи-дом. Избирательность и прочность аффинной связи обусловлены кооперативным действием различных сил в области связывания, где они дополняют друг друга. Благодаря такой кооперации имеется возможность ввести в буфер факторы, ослабляющие действие сил какого-либо типа или даже всех их одновременно, но в такой степени, что биоспецифическое аффинное взаимодействие будет ослаблено лишь частично, в то время как неспецифическую сорбцию удастся подавить практически полностью. [27]

Однако обнаружено, что хроматография химотрипсина на незамещенной сефарозе не дает достаточных доказательств отсутствия неспецифической сорбции. Напротив, Хофсти [12] показал, что сефароза с иммобилизованным метиловым эфиром е-амино-капронил-о - триптофаном сорбирует, например, сывороточный альбумин или у-глобулин полностью неспецифически. [28]

Гидрофильные свойства нерастворимых носителей желательны не только потому, что необходимо свести к минимуму неспецифическую сорбцию и инактивацию, но также и потому, что на носителях с гидрофобными свойствами может уменьшаться стабильность некоторых связанных ферментов в результате денатурации, аналогичной той, которая вызывается органическими растворителями. [29]

Влияние рН на связывание лактатдегидрогеназы мышцы сердца свиньи е-аминогексаноил - МАВ - сефарозой ( а и № - ( 6-аминогексил - АМР - сефарозой. [30]

Страницы: 1 2 3 4