Cтраница 4
С увеличением исходной концентрации белкового лиганда абсолютное количество связавшегося материала медленно увеличивается, но доля связывания снижается ввиду стерических помех, которые создают друг для друга крупные молекулы белка при связывании с близко расположенными активными центрами матрицы. Кроме того, излишне высокая исходная концентрация лиганда стимулирует повышенный уровень неспецифической сорбции, что снижает избирательность сорбента. [46]
Приготавливают Н3 - ДНК-фильтры так, как это описано в разд. Для каждой используемой концентрации РНК в каждом опыте необходимо параллельно определять неспецифическую сорбцию РНК. Фильтры промывают и обрабатывают РНК-азой так, как это описано в разд. Поэтому из величины радиоактивности Р32 необходимо вычесть фон. В результатах опытов, приведенных в табл. 1, неспецифической сорбцией можно пренебречь, однако довольно часто она бывает достаточно высокой. [47]
Вместе с тем неизбежно должно происходить образование менее совершенных двунитевых структур, когда случайное комплементарное соответствие имеет протяженность в несколько нуклеотидов или когда в более длинных комплементарных участках есть отдельные некомплементарные пары оснований. Связывание НК на нуклеиновом аффинном сорбенте в результате такого несовершенного спаривания следует считать артефактом неспецифической сорбции. Для удаления неспецифически сорбированных НК можно воспользоваться различием в прочности совершенных ( специфических) и несовершенных двунитевых структур. С этой целью варьируют силу денатурирующих воздействий среды, подбирая их таким образом, что образование несовершенных двунитевых структур оказывается затрудненным при посадке вещества на сорбент, а все же образовавшиеся структуры такого рода диссоциируют при промывке. В то же время эти воздействия должны быть достаточно умеренными, чтобы не мешать образованию и сохранению совершенных, истинно комплементарных двунитевых структур. В качестве денатурирующих агентов используют обычно формамид и повышение температуры. Концентрация формамида 50 % при температуре около 40 отвечает постав ленным требованиям. [48]
Благодаря рыхлой структуре агарозы на ней возможно взаимодействие даже больших молекул биополимеров, а из-за ее инертной природы на ней не происходит неспецифической сорбции, которая была бы нежелательна. [49]
Редокс-ионообменники представляют собой обычные, ионообменные полимеры, содержащие обратимые окислительно-восстановительные пары, например Fe. Такие пары либо содержатся в полимерах, либо существуют в виде противоионов, либо возникают в результате как специфической, так и неспецифической сорбции. Анионообменники, содержащие ионы меди, были созданы для удаления кислорода, растворенного в воде. Как злектрообменники, так и редокс-ионообменники характеризуются окислительно-восстановительной емкостью ( окислительно-восстановительный эквивалент ионообменной емкости), окислительно-восстановительным потенциалом ( аналогичным потенциалу мембраны) и скоростями протекающих в них реакций. [50]
Приемы, используемые в аффинной хроматографии, в основном те же, что и в других рассмотренных выше методах, поэтому достаточно будет остановиться лишь на некоторых отличительных особенностях. Уже упоминалось, что в большинстве случаев решается задача аффинной очистки одного вещества, сила связывания которого на сорбенте намного превосходит силы неспецифической сорбции других компонентов исходной смеси. Это позволяет эффективно использовать аффинную хроматографию и на ранних стадиях очистки вещества. Нередко на этой стадии в препарате могут содержаться выпавшие в осадок белки или липопротеиды, способные забивать колонку. [51]
Чаще других сегодня используются сорбенты типа Oligo ( dT) - cellulose фирмы Collaborative Research. Из трех типов сорбентов этого типа ( Tl, Т2 и ТЗ) наибольшей популярностью для очистки мРНК пользуется ТЗ, характеризующийся меньшим уровнем неспецифической сорбции при более высокой, чем у других типов, емкости. [52]
Здесь в распоряжении эксперимента имеется довольно обширный арсенал средств, ослабляющих прочность биоспецифического комплекса. Имея в виду сделанные выше замечания, не приходится удивляться тому, что в этот арсенал входят те же средства, что и для предотвращения неспецифической сорбции: увеличение ионной силы раствора, изменение рН, введение мочевины, гуанидинхлорида, детергентов, органических растворителей, удаление двухвалентных ионов, повышение температуры. Разница лишь в выборе соответствующих агентов и их концентрации, которая здесь должна быть достаточной для того, чтобы преодолеть кооперативный эффект действия сил аффинного сродства. Для стационарного варианта хро-матографической элюции это преодоление опять-таки должно быть полным, а для динамического - частичным. В последнем варианте нередко используют градиентную элюцию с присущим ей преимуществом сужения зоны элюируемого вещества. Конкретные примеры различных вариантов неснецифической элюции приведены ниже, а сейчас отметим, что зачастую удается ограничиться сравнительно мягкими воздействиями: менее 1 М NaCl, 4 - 6 М мочевина, изменение рН в пределах 4 - 10, менее 1 % неионного детергента, около 10 % диоксана или до 50 % этиленгликоля. Однако в случае сильного аффинного сродства ( KL 10 - e M) этого может быть недостаточно, и приходится использовать гуанидинхлорид или хаотроп-ные агенты, например тиоцианат калия. [53]
Преимуществами метода Касаи и Ишии [10] являются его чувствительность и простота: для исследования необходимо лишь небольшое количество белка; по сравнению с методом Данна и Чейкена [7] в этом методе концентрация фермента очень мала относительно KL, использование фронтального анализа упрощает выведенные уравнения; объемы элюирования можно определить более точно, поскольку они практически не зависят от концентрации. При использовании этого метода для определения констант диссоциации химотрипсина на сфероне, к которому был привязан с помощью гидрофобного гексаметилендиамина N-бензилоксикар-бонилглицил - о-фенилаланин, Туркова и др. [15] встретились с трудностями, обусловленными, очевидно, неспецифической сорбцией. [54]
Роль неспецифической сорбции возрастает при очень малых загрузках колонки. В таких случаях перед началом хроматографии имеет смысл добавить в препарат балластную гетерологичную ДНК до общей загрузки, составляющей не менее 50 мкг ДНК на 1 мл объема колонки. Разумеется, это можно делать лишь в том случае, когда имеется возможность регистрировать на выходе из колонки только исследуемую ДНК, например если она радиоактивна. [55]
Олигонуклеотиды несут большой отрицательный заряд, поэтому они с успехом могут быть разделены на слабых крупнопористых анио-нообменниках. Для этой цели используют колонки, заполненные ДЭАЭ-сефадексом, ДЭАЭ-целлюлозой, Эктеола-целлюлозой и др. Нук-леотиды элюируются с колонки в градиенте концентрации NaCl в порядке увеличения их молекулярной массы. Для подавления неспецифической сорбции нуклеотидов на полисахаридных матрицах хроматографию проводят в присутствии 7 М мочевины. [56]
Однако вопрос их практического использования в больших, масштабах не решен еще с экономической точки зрения. Напротив, разработка таких носителей, как стекло и керамические материалы, более целесообразна именно для практического использования. К их недостаткам относятся относительно высокая неспецифическая сорбция, а также чувствительность к щелочному гидролизу. Однако соответствующая модификация или обработка поверхности в значительной степени позволяет преодолеть эти недостатки. Ввиду того что целлюлоза является одним из наиболее дешевых носителей, она большей частью используется экспериментаторами, интересующимися практическими приложениями. Биоспецифические сорбенты, основанные на целлюлозе, в отличие от других сорбентов очень часто обнаруживают отклонение от поведения, ожидаемого на основании степени замещения. [57]
Однако значительно большие возможности открывает нековалент-ное связывание НК с матрицей целлюлозы. Во-первых, его удается осуществить и для относительно малых фрагментов НК, а во-вторых, с целлюлозой можно связать и нативную двунитевую ДНК. Способы такого связывания используют неспецифическую сорбцию, вернее, запутывание нитей НК в сетке целлюлозы. Здесь это происходит успешнее, чем в агарозе, у которой пустоты крупнее, а нити собраны в плотные жгуты. Во многих случаях связь оказывается достаточно прочной, чтобы обеспечить надежное задержание НК в колонке аффинного сорбента в условиях многократных промывок, связывания и элюции очищаемых макромолекул. [58]
Какие из препятствующих молекулярному взаимодействию агентов действительно нужны для подавления неспецифической сорбции - в каждом конкретном случае решает эксперимент. Использование для страховки всех возможных средств подавления сорбции неразумно. Дело в том, что неспецифическая сорбция может и помогать аффинному взаимодействию. Так, можно себе представить механизм, по которому и само нужное вещество сначала лабильно связываетс-i с лигандом или его спейсером за счет неспецифического гидрофобного взаимодействия, а потом, изменив свою ориентацию в пространстве, нащупывает и биоспецифическое взаимодействие, возникающее при сближении участков взаимного узнавания на поверхностях вещества и лиганда. [59]