Cтраница 4
Интересно, что мембрану приходится смазывать такими веществами, как олеат натрия или гликохолят натрия, для того, чтобы молекулы белка проходили через мембрану. Смазывающие агенты не изменяют размеров пор мембраны, но, вероятно, понижают адсорбцию белка на мембране. [46]
В главе об электрокинетических явлениях мы указали, что при микроэлектрофоретическом измерении подвижности белков пользуются адсорбцией белков из растворов на инертных частицах, например на измельченном кварце, которые должны иметь достаточные размеры, чтобы быть видимыми в микроскоп. Несмотря на большой интерес и важность этого вопроса, имеется мало количественных работ по адсорбции белков. [47]
По данным Г. П. Шумакович и Б. А. Кузнецова, скорость денатурации превышает 10 с-1. Только в случае фос-форилазы имеет место небольшая задержка поверхностной денатурации ( более чем на 5 с), что объясняется последовательными процессами денатурации двух субъединиц, одна из которых временно оказывается во втором слое. При этом, в отличие от Берга и других исследователей, которые высказывали мнение о сохранении нативной конформации белка ( или небольшой обратимой денатурации) при адсорбции на ртутном капающем электроде, Кузнецовым показано, что и в случае адсорбции белков в условиях полярографических исследований на капающем электроде ( время 0 5 - 7 с) имеют место такие же процессы, как и на стационарном электроде. [48]
Для решения проблемы устойчивости эмульсий и связанного с ней вопроса о строении межфазных слоев представляет интерес сравнение механических свойств таких слоев поверхностно-активных полимеров на границе раздела водный раствор - воздух и водный раствор - углеводород. Рассмотрим сначала наиболее простой случай развития межфазной прочности водных растворов глобулярных белков на границе с воздухом. Известно, что в водных растворах молекулы яичного альбумина, сывороточного альбумина, казеина находятся в виде тлобул и большинство неполярных групп создают гидрофобные области внутри глобулы. При адсорбции белка на поверхности в результате избытка свободной энергии на границе раздела фаз происходят конформационные изменения адсорбированных молекул, так как нарушается равновесие сил, стабилизующих глобулу. Развертывание макромолекул на границе раздела фаз сопровождается глубокими изменениями в третичной структуре, вследствие чего большинство гидрофобных групп ориентируется к воздуху. Агрегация денатурированных макромолекул и обусловливает нарастание прочности межфазного адсорбционного слоя. Возникающий при агрегации макромолекул тип структуры, создающийся множеством межмолекулярных гидрофобных связей [20], напоминает р-структуру параллельного типа. [49]
Полученное таким образом значение для среднего коэффициента диффузии, зависящее от константы устойчивости комплекса, и следует подставлять в уравнение Ильковича. Качена и Матоушек [26] на примере комплексов Cd2 с белками показали, что выведенные теоретически соотношения хорошо согласуются с экспериментом. Вывод выражения для среднего коэффициента диффузии, проведенный здесь, также предложен этими авторами. Надо отметить, что в выбранном Каченой и Матоушком примере электродный процесс может быть осложнен адсорбцией белка на поверхности электрода. [50]
Необходимое количество геля подбирают следующим образом. В несколько пробирок наливают одинаковое количество ферментного раствора ( минимальный объем) и добавляют разные количества геля. Перемешивают до получения однородной суспензии, центрифугируют и в центрифуге определяют ферментативную активность. То соотношение геля к ферментному раствору, при котором в надосадочной жидкости остается примерно 90 % первоначальной активности при адсорбции балластных белков и около 10 % при адсорбции исследуемого фермента, считается оптимальным. На основании полученного соотношения рассчитывают количество геля, которое необходимо добавить на весь объем ферментного раствора. [51]
Поскольку размеры молекул белкового адсорбата в исследованных системах сопоставимы с размерами мезопор ( так, молекула сывороточного альбумина представляет собой в растворе эллипсоид вращения с размерами 14 0x4 0x4 0 нм), то в этом случае, по-видимому, нельзя говорить о миграции молекул адсорбата в адсорбционном слое; основным фактором, определяющим скорость адсорбции молекул с большой молекулярной массой в мезопористых сорбентах, является диффузия растворенных молекул в порах. На скорость адсорбции влияют также рН раствора, наличие полярных групп на поверхности адсорбента. При рН раствора, близком к изоэлектрической точке белка, величина адсорбции максимальна. Приведенные закономерности свидетельствуют о преобладающем вкладе дисперсионных сил в адсорбцию белков на углеродных сорбентах. [52]
Кроме очистки стоков от загрязняющих веществ, немаловажное значение имеет извлечение ценных компонентов из растворов. Сорбционное концентрирование широко применяется в аналитической химии белков, так как позволяет избирательно выделять эти вещества из биологических сложных систем. Изучена адсорбция бычьего сывороточного альбумина ( БСА) на незаряженной и поляризованной поверхности исходного и модифицированного гидроксидом титана углеродного волокна. Подобраны оптимальные условия иммобилизации белков на тонкослойных сорбентах. Показано, что для тонкослойных покрытий гидроксидом титана степень обратимости адсорбции белка зависит от текстуры исходной матрицы. Изменение заряда поверхности волокна оказывает значительное влияние на адсорбируемость БСА модифицированным сорбентом, что обусловлено различными поверхностными свойствами исходного и титансодержащего волокна. Подобраны условия электродесорбции БСА с поверхности волокнистых материалов. [53]
В последующие годы продолжалось применение адсорбционных методов для получения различных белков и были разработаны новые методы. Часто оказывается возможным найти адсорбент, который довольно селективно адсорбирует один из компонентов смеси, вследствие чего происходят выделение и одновременное концентрирование этого компонента. Несмотря на то что общие законы адсорбции хорошо изучены, подбор адсорбента, пригодного для выделения данного конкретного белка, является, повидимому, в значительной степени эмпирическим. Повидимому, вещества с наиболее сильными адсорбционными свойствами ( насколько можно судить по адсорбции на них газов и простых органических соединений) будут обладать слишком большой адсорбционной способностью, но недостаточной селективностью по отношению к белкам. Систематические исследования по адсорбции чистых белков на различных веществах, повидимому, отсутствуют. [54]
Касаи и Ишии [22] нашли, что для сорбции трипсина на сефарозе с присоединенным глицилглицилар-гинином оптимальным является рН 5 6, однако это значение не является оптимальным для катализа. Следовательно, полезно определить оптимальные условия образования каждого индивидуального комплекса выделяемого вещества с иммобилизованным аффинным лигандом. Из рис. 3.1 следует, что повышение ионной силы буфера приводит к снижению количества сорбированного химотрипсина. Такое возрастание задержки выхода нельзя, однако, объяснить увеличением ионной силы, поскольку положение пика фермента не меняется, если ионную силу 0 05 М фосфатного буфера увеличить, добавляя раствор 0 9 М хлорида натрия. Задержка выхода фермента имеет место не только в фосфатно-цитратном буфере, но также в сульфатном или фосфатном; однако степень задержки выхода, конечно, различна. Для ряда карбоновых кислот, используемых при доведении 0 5 М гидрофосфата натрия до рН 6 0, найдено, что задержка выхода фермента возрастает с увеличением основности кислот в такой последовательности: ацетат сукцинатцитрат. Ребо и др. [33] отмечают, что наиболее важными факторами, влияющими на адсорбцию белков на алкил - сефарозе, являются наряду с длиной алифатической цепи концентрация и природа присутствующих в среде солей. Важная роль солей в гидрофобной хроматографии детально рассмотрена в разд. [55]