Cтраница 3
Из этих опытов ясно, что фермент, полученный путем осаждения ацетоном и очищенный от примесей обезжириванием и извлечением слабой кислотой, дает меньший выход салициловой кислоты в атмосфере воздуха, чем в атмосфере водорода. Таким образом, очищенный фермент сохраняет вою способность производить одновременно окисление и восстановление двух молекул альдегида за счет воды, но не способен окислять салициловый альдегид посредством молекулярного кислорода. Другими словами, фермент может функционировать как редуказа или оксидо-редуказа, но не как оксидаза. [31]
Используя экстракты тканей и очищенные ферменты, они выяснили, какие изменения претерпевают различные фосфорные эфиры Сахаров, и затем, как детскую составную картинку, сложили все стадии этого процесса в единое целое. За эту работу супруги Кори в 1947 году были удостоены Нобелевской премии в области физиологии и медицины. [32]
Среди сериновых протеаз на первом месте стоит субтилизин Carlsberg. При участии Bacillus licheniformis ежегодно производится около 500 т очищенного фермента. Сериновые протеазы не гидролизуют белки до аминокислот. [33]
Однако, на практике такие биокатализаторы пока еще применяются редко, вероятно, из-за опасения возможных побочных трансформаций субстрата и целевого продукта под действием других клеточных ферментов, а также из-за необходимости транспорта субстрата и продукта через цитоплазматическую мембрану и клеточную стенку. Вместе с тем, клеточные катализаторы могут иметь определенные преимущества перед очищенными ферментами, связанные, прежде всего, с более низкой стоимостью катализатора и возможностью многократного использования. [34]
Белки различаются по своей устойчивости к денатурации. С другой стороны, повседневный опыт ферментолога говорит о том, что многие очищенные ферменты даже на холоду устойчивы в растворенном состоянии всего лишь в течение нескольких дней или часов. [35]
Роль фермента частично может выполнять ион металла - он сближает реагенты в подходящем относительном расположении и вносит в реакцию дополнительный электрофильный центр, содействующий оттягиванию электронов. Это, однако, не отражает сущности ферментативного катализа, поскольку было показано, что некоторые очищенные ферменты с пиридоксальфосфатом в качестве кофермента не содержат в молекуле металлов. [36]
Результаты приведенных выше опытов не позволяют еще решить, играет ли роль антигенов активная молекула фермента пли сопутствующие примеси белкового характера. Для того чтобы ответить на этот вопрос, были поставлены опыты в двух различных направлениях: 1) иммунизация очищенным ферментом и 2) иммунизация ипактивированным ферментом. Мы исходили из следующих соображений: если роль антигена играет активная молекула фермента, то иммунизация очищенными препаратами должна привести к таким же активным иммунным сывороткам, как и с неочищенными препаратами, а при иммунизации инактивированным ферментом вообще нельзя ожидать, что получится иммунная сыворотка. Наоборот, если антигенами являются белковые примеси, то антиферментативные свойства иммунной сыворотки должны быть тем слабее, чем чище препарат, применяющийся для иммунизации. [37]
Экспериментальные приемы, применяемые в биохимии для изучения метаболизма, разнообразны. Исследования химических превращений проводятся на уровне целых органов, в тонких срезах и клеточных культурах, в гомогенатах тканей, органелл и очищенных ферментов. В любом эксперименте важную роль играют методы количественной регистрации химических превращений. Гравиметрические методы недостаточно чувствительны и часто непригодны для анализа органических соединений. Поэтому в биохимии широко применяются спектро-фотометрические и колориметрические методы, имеющие высокую чувствительность и позволяющие определять очень небольшие количества веществ. Некоторые превращения сопровождаются поглощением или выделением газа. Для количественной регистрации таких превращений применяются манометрические методы. [38]
О дальнейших стадиях процесса фиксации азота известно немногое. Не обнаружено никаких промежуточных продуктов, предшествующих выделению аммиака, и, вероятно, не изучены реакции таких возможных интермедиатов, как гидразин, с очищенными ферментами. [39]
Для обеспечения НАДФН-нитратредуктазной диссимиляции требуются железо и молибден. В этом отношении фермент из указанного источника аналогичен нитратредуктазе из денитрифицирующих бактерий. Однако большинство очищенных ферментов не меняли свою активность в присутствии хелатирующих железо реагентов, содержали тем меньше железа, чем хуже были очищены препараты, и в них не были обнаружены цитохромы или флавин. НАДФН не является эффективным донором электронов для очищенного фермента, тогда как бензилвиологен ( N, М - дибензил-4 4 -ди-пиридил) может выступать в этом качестве. Эти наблюдения согласуются с гипотезой, согласно которой НАДФН-нитратредуктазная активность обеспечивается двумя ферментами [78]: один из них - ФАД-зависимая НАДФН-диафораза, которая может использовать в качестве акцепторов электронов многие вещества, в том числе окисленный цитохром с; другой фермент - это собственно концевая нитратредуктаза, молибденсодержащий белок, использующий в качестве доноров электронов восстановленные флавин-нуклеотиды. [40]
При этом специфичность расщепления различных точек цепи очищенными ферментами не абсолютна, а относительна. Это означает, что приведенная схема есть наиболее вероятная, но не единственно возможная. Не исключено, конечно, что существование различных путей расщепления связано с неполной очисткой ферментных препаратов. [41]
Фермент, катализирующий вышеприведенную реакцию, найден у растений. Потребность этого фермента в 2 3-дифосфоглицериновой кислоте в качестве кофермента указывает на то, что он подобен фосфоглюкомутазе. Однако фосфо-фермент еще не найден; при исследовании выделенного из мышцы кролика очищенного фермента не установлена потребность его в ионах металла. Получены данные, что в некоторых растительных тканях, возможно только в семенах, содержится какая-то фосфоглицеромутаза, которая не требует 2 3-дифосфоглицериновой кислоты; этот фермент катализирует прямое превращение 3-фосфоглицериновой кислоты в 2-фосфогли-цериновую. [42]
В противоположность аминотрансферазам животных тканей и микроорганизмов растительные аминотрансферазы продолжают оставаться недостаточно четко охарактеризованной группой, в частности это относится к их специфичности в отношении амино - и кетокислот. Подобный вывод был сделан в отношении аминотрансферазы из проростков маша, поскольку скорости переаминирования различных аминокислот с а-кетоглутаратом были в данном случае аддитивными; если бы все реакции переаминирования катализировались одним ферментом, то конкуренция между аминокислотами за доступные молекулы фермента приводила бы к взаимному ингибирующему действию. Однако решающие доказательства довольно высокой специфичности растительных аминотрансфераз были получены в немногочисленных исследованиях, проведенных с очищенными ферментами. Аспартат-глутамат - аминотрансфераза из головок цветной капусты была очищена более чем в 20Q раз [23], причем оказалось, что фермент обладает довольно высокой субстратной специфичностью. При использовании оксалоацетата в качестве акцептора аминогруппы помимо глутамата в какой-то степени активными донорами аминогруппы были только цистеиновая и цистеинсульфиновая кислоты. Эти серусодержащие аминокислоты, напоминающие глутаминовую кислоту тем, что они содержат вторую карбоксильную группу у р-углеродного атома, реагируют примерно в 4 раза слабее, чем нормальный субстрат. [43]
Рассмотренные до сих пор вопросы ферментативного катализа относились к свойствам ферментов как индивидуальных веществ, которые в ряде случаев были выделены в чистом виде и изучены с химической точки зрения. Однако несомненно, что свойства фермента в месте его нахождения в живой клетке могут во многом отличаться от свойств чистых ферментов, и эти отличия представляют большой физиологический интерес. Изучение неочищенных ферментов может выявить их важные особенности, ускользающие от внимания исследователей, работающих с очищенными ферментами. [44]
Большинство исследователей, занимающиеся биохимической генетикой и функциями нуклеиновых кислот, считали, что ДНК образуется только за счет репликации других молекул ДНК - Если транскрибирование РНК с ДНК может протекать свободно, то обратный процесс, а именно образование ДНК на РНК-матрице, считался маловероятным. Этот фермент обнаруживается в зрелых вирусных частицах. Наиболее тщательно очищенный фермент вирусов миелобластоза птиц состоит из двух белковых субъединиц, имеющих мол. Для функционирования фермента необходима короткая затравка и матричная цепь РНК - При этом сначала получается гибрид ДНК - РНК, из которого затем ( вероятно, после гидролитического расщепления цепи РНК под действием РНКазы Н, разд. [45]