Фракционирование - белок
Cтраница 2
Обычно для фракционирования белков сыворотки используют рекомендованное выше напряжение 110 В, при котором разделение длится от 14 до 16 ч, и охлаждения не требуется. Для особых целей напряжение может быть увеличено, но, согласно закону Джоуля, при этом соответственно увеличится теплообразование. [16]
Помимо очистки и фракционирования белков, связывающих мРНК, поли ( А) - сефароза нашла себе применение для выделения некоторых ядерных и вирусных РНК, несущих в своем составе достаточно протяженные поли ( и) - участки. Функции этих участков пока не вполне понятны. С аналогичной целью были разработаны и поставляются в готовом виде ( фирмы PL-biochemicals, Sigma) сходные аффинные сорбенты с другими иммобилизованными полири-бонуклеотидами: поли ( С) -, поли ( О) -, поли ( 1) - агарозы и даже сорбент смешанного типа - поли ( 1) - поли ( С) - агароза. [17]
Существует много методов фракционирования белков. Некоторые из них мы здесь рассмотрим. [18]
В процессе выделения и фракционирования белков необходимо принимать известные меры предосторожности. Молекулы белков весьма неустойчивы. Инкубация белков даже при умеренной температуре, например при 37, приводит, как правило, к их частичной денатурации. Большинство операций при очистке белка должно поэтому проводиться при температуре, близкой к точке замерзания используемого растворителя. Некоторые белки, однако, довольно устойчивы к нагреванию. Кратковременная тепловая обработка при выделении таких белков оказывается весьма полезной, так как дает возможность осадить большую часть загрязняющего материала. [19]
Хроматографический метод очистки и фракционирования белков на карбоксильной смоле Амберлит IRC-50 успешно применен к следующим белкам: цитохрому С, рибонуклеазе, лизоциму, химотрипсиногену, химотрипсину, гиалуронидазе, гемоглобинам, адренокортикотропному гормону, инсулину и др. Среди этих работ следует отметить обнаружение двух хроматографически активных белков, обладающих активностью рибонуклеазы, доказательство распада индивидуального лиофилизованного лизоцима при комнатной температуре и лиофилизованной рибонуклеазы при 0 С. Наибольшее значение тонкая хроматографическая очистка белка имеет при изучении первичной его структуры и физико-химических констант, характеризующих вторичную и третичную структуры. [20]
На каком различии основано фракционирование белков методом гель-фильтрации: а) по растворимости; б) по форме молекулы; в) по суммарному заряду; г) по молекулярной массе; д) по первичной структуре. [21]
Полученный осадок глобулина после фракционирования белка переносят в цилиндр 1, заполненный 10 мл дистиллированной воды. Диализ обычно ведут в течение суток в холодном помещении ( от 0 до 2 С), сменяя несколько раз воду. Отсутствие осадка при добавлении раствора ВаС12 свидетельствует об окончании диализа. В сухом виде препарат хорошо сохраняется. [22]
В ходе обычного процесса фракционирования белков свободные липиды легко отделяются от белковых фракций вследствие их относительной нерастворимости; они могут быть также удалены на любой стадии процесса при помощи экстрагирования подходящими растворителями. Недавно появилось сообщение [26] об исследовании очищенного f - липопротеина плазмы. [23]
Гель-фильтрация все шире используется для фракционирования белков сыворотки. Наиболее подходящим в данном случае является сефадекс G-200. С колонки этого геля белки сыворотки элюи-руются тремя пиками. Первый пик соответствует в основном липо-протеидам и макроглобулинам, вторым пиком выходит IgG, в третьем пике содержатся главным образом альбумин и трансферрин. [24]
 |
Гель-хроматография на колонке с сефадексом ( схема. [25] |
Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков ( как и методов оценки гомогенности) является диск-электрофорез ( от англ, discontinuous - прерывистый, перемежающийся) в полиакриламид-ном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями рН и разной степени пористости гель. Следует отметить высокую разрешающую способность гель-электрофореза. Если при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге открываются всего 6 фракций, то при электрофорезе в крахмальном геле - 10, а в полиакрил-амидном геле-до 18 разных белковых фракций. [26]
Одним из широко применяемых методов фракционирования белков является высаливание нейтральными солями. Впервые этим способом были отделены глобулины от альбуминов. Глобулины осаждаются при 50 % - ном насыщении сернокислым аммонием, а альбумины - при более высокой концентрации. Сульфат натрия, обладая меньшей растворимостью, чем сернокислый аммоний, осаждает только глобулины. [27]
В последние годы широкое распространение для фракционирования белков получили различные сочетания изоэлектрофокусирования и диск-электрофореза в полиакриламидном геле-методы двухмерного электрофореза, которые позоляют параллельно анализировать сотни и даже тысячи белковых фракций. [28]
Кратко рассмотрим современные методы очистки и фракционирования белков. [29]
Для разделения двух изозимов следует провести дополнительное фракционирование белка с использованием хроматографии на КМ-цел-люлозе и повторно - на ДЭАЭ-целлюлозе. [30]
Страницы: 1 2 3 4