Фронт - элюент
Cтраница 3
В препаративной системе, разработанной Солм-сом [24], в качестве хроматографической среды используется цилиндр из бумаги, вращающийся в горизонтальной плоскости под углом 90 к направлению движения фронта элюента. Разделяемая смесь непрерывно подается из капиллярной трубки в определенную точку на верху бумаги, а компоненты смеси движутся по спирали. Отдельные фракции собираются в приемники у основания цилиндра и направляются на анализ. Солмс использовал данную систему для разделения смесей хлоридов литая и калия, ксилозы и галактозы, метиленового голубого и фуксина. [31]
Rf, больших 0 6 и 0 7, затруднено детектирование, поскольку с увеличением Rf возрастает площадь зоны и уменьшается поверхностная концентрация вещества. Величины RfKp в круговой ТСХ, так же как и в линейной ТСХ, обозначают соотношение расстояния, пройденного веществом, к расстоянию от места нанесения пробы до линии фронта элюента. [32]
 |
Вид тонкослойной хро-матограммы ( а - а - линия старта, Ь - 6-линяя фронта. [33] |
Для осуществления этого вида ТСХ элюент шг-ливают на дно хроматогра-фической камеры, а нижний край пластины с нанесенными пробами помещают в растворитель. Фронт элюента при этом перемещается снизу вверх. [34]
Пипеткой отбирают 2 мл этого раствора, содержащего около 250 мг оксиэтилированных алкилфенолов, и подают на поверхность слоя силикагеля в верхней секции. Открывают нижний кран и поддерживают слой элюента указанной толщины на верхней секции постоянным. Когда фронт элюента достигнет отметки на 5 мм выше стеклянного фильтра нижней секции, снимают напорную склянку. После впитывания всего элюента в слой и появления первых капель внизу 10-ой секции колонки, закрывают нижний кран. Продолжительность элюирования оксиэтилированных алкилфенолов оставляет 55 - 65 мин. [35]
Пластинку предварительно уравновешивали в парах этой смеси. За 10 мин фронт элюента доходил до верхнего края пластинки. [37]
С момента погружения пластинки в элюент возникает фронт смачивания, который перемещается по слою сорбента. При этом с током элюента перемещаются также и исследуемые вещества со скоростью, зависящей от их коэффициентов адсорбции. К моменту, когда фронт элюента ( граница увлажнения) достигнет верхней части слоя сорбента, хроматографическое разделение заканчивается. Вещества, имеющие окраску, обнаруживаются на хроматограмме в виде отдельных пятен. Если хроматографируются бесцветные вещества, в зависимости от их природы приходится поступать различным образом. Иногда достаточно к сорбенту добавить люминофор, чтобы в УФ свете обнаружить на хроматографической пластинке пятна исследуемых веществ. В других случаях пластинку приходится опрыскивать специальными реагентами, образующими окрашенные соединения с исследуемыми веществами. [38]
Циглер и Филлипс [32] использовали двумерное ТСХ-разде-ление для идентификации и обнаружения хлорфенолов в пробах воды до и после ее обработки на очистном заводе. Разделение в сэндвич-камере прекращали, когда фронт элюента ( бензол) перемещался на расстояние 7 - 10 см. Это разделение, проводили для удаления нежелательных примесей и в случае необходимости его можно повторить. [39]
Воспроизводимость величин RJ в основном зависит от толщины слоя сорбента вдоль пути разделения. Как показывают предварительные исследования, это относится в большей степени к макро - ТСХ, чем в ВЭТСХ. С другой стороны, при искривлении фронта элюента величины RJ изменяются. Анализ обоих растворов проводят на разных половинках одной и той же пластинки. [40]
Метод разделения 2 4-динитрофенилгидразонов, описанный Мейгхом [46, 47], позволяет разделять летучие альдегиды и кето-ны в концентрации примерно 10 - 7 М в петролейном эфире. В этом случае использовали фильтровальную бумагу Ватман № 1, а в качестве элюента - смесь метанола и гептана. Разделение проводили нисходящим методом в течение 1 ч, при этом фронт элюента продвинулся на 20 см. К элюенту, использованному Мейгом ( 1 / д-ный раствор метанола в гептане) [46, 47], Валлгрин и Норлунд 48 ] добавили 10 % ледяной уксусной кислоты в соотношении ( 4: 1) по объему после того, как листы бумаги были приведены в равновесие с двухфазной системой растворителей. [41]
После исчерпывающего гидролиза меченных 32Р оли-горибонуклеотидов или РНК Т - и Т2 - РНКазами до З - нуклеотпдов они наносили пятна гидролизатов на линию старта вдоль длинной стороны пластинки PEI-целлюлозы размером 10 X 6 5 см ( такие пластинки нарезали из продажных Polygram CEL-300) и вели одномерную двухступенчатую элюцию. Оба процесса элюции занимали по 10 мин; за это время фронт элюента доходил до верхнего края пластинки. Пятна мононуклеотидов обнаруживали по гашению флюоресценции целлюлозы при УФ-освещении и авторадиографически. В 0 5 % - ной НСООН положительные заряды цитозина и аденина достаточно велики, чтобы заметно мешать соответствующим нуклеотидам задерживаться на полиэтиленимине. UMP и GMP остаются при этом практически еще на старте. Дальше следует ионообменная хроматография: ионы формиата вытесняют из связи с анионообменни-ком все четыре нуклеотида, а ионы Li 1 нейтрализуют заряды фосфатов. Для GMP этому процессу способствует еще и некоторый положительный заряд, благодаря чему он уходит вперед от UMP. [42]
 |
Механизм сжатия зоны при многократной ТСХ.| Схема многократной ТСХ с программированием подачи элюента на. [43] |
Применение пластин для ВЭТСХ при МТСХ позволяет оптимизировать разделение сложных смесей, так как дает возможность уменьшить длину пробега и время в каждом цикле. Это повторяющаяся ТСХ в одном элюенте в одном направлении с постепенно увеличивающимися расстояниями пробега элюента. При МТСХ сжатие зон происходит дважды: при пересечении ее с фронтом элюента ( поджимается нижняя граница зоны) и за счет медленного его отступления при испарении, при этом верхняя граница зоны не движется или движется вниз, а нижняя продолжает двигаться вверх, пока фронт не остановится. В результате зона сильно сжимается при увеличении числа циклов. [44]
Однако бумага как носитель не лишена некоторых недостатков. Она имеет низкую емкость по отношению к экстрагентам, что вынуждает работать с, очень небольшими количествами элементов и осложняет последующее детектирование элементов. Скорость злюирования меняется в зависимости от количества нанесенного экстрагента или ионной силы элюента; она также меняется по мере движения фронта элюента. Величина скорости злюирования имеет большое значение, так как часто кинетические эффекты влияют на механизм удерживания. Кроме того, вдоль хро-матограммы может меняться отношение объемов фаз, а также концентрация компонентов в элюирующем растворе. Несмотря на это, в большинстве случаев результаты, полученные на бумаге, сравнимы с результатами, полученными методами, которые свободны от этих недостатков. [45]
Страницы: 1 2 3 4