Фронт - элюент
Cтраница 4
В первом случае необходимо изменять состав подаваемого на пластинку элюента, постепенно добавляя к осадителю растворитель. Во втором случае должна постепенно уменьшаться концентрация осадителя в движущемся по пластинке элюирующем растворе, например за счет преимущественного испарения растворителя вблизи фронта элюента при ТСХ в ненасыщенной С-камере. [46]
Решение проблемы лежит в переходе к градиентной элюции, обусловливающей изменение ( уменьшение) значений коэффициентов распределения ( К) системы компонентов в ходе самой элюции. Это осуществляется за счет изменения состава ( или температуры) элюента, как подробно описано ниже для каждого типа хроматографии. При этом вовсе не обязательно дожидаться выхода компонентов группы 1 из колонки. Когда фронт сильного элюента настигнет эти компоненты ( уже разделившиеся) где-то на колонке, он их подхватит и почти без задержки вынесет наружу. [47]
Для проведения анализа методом тонкослойной хроматографии используют 0 5 - 1 % - ные растворы испытуемого вещества или смеси веществ в легколетучем растворителе. Около 0 05 мл такого раствора наносится на некотором удалении от нижнего края хроматографиче-ской пластинки ( см. с. С момента погружения пластинки в элюент возникает фронт смачивания, который перемещается по слою сорбента. При этом в токе элюента перемещаются также и исследуемые вещества со скоростью, зависящей от коэффициентов адсорбции. К моменту, когда фронт элюента ( граница увлажнения) достигнет верхней части слоя сорбента, хроматографическое разделение заканчивается. Вещества, имеющие окраску, обнаруживаются на хроматографе в виде отдельных пятен. В том случае, когда хроматографируются бесцветные вещества, в зависимости от их природы поступают различным образом. В ряде случаев достаточно к сорбенту добавить люминофор, чтобы при освещении хроматографической пластинки УФ-светом обнаружить на ней пятна исследуемых веществ. В других случаях пластинку приходится опрыскивать специальными реагентами, образующими окрашенные соединения с исследуемыми веществами. [48]
Одновременно с рассмотренным выше методом разделения З - рибонуклеотидов одномерной ионообменной ТСХ на пластинках PEI-целлюлозы размером 10 X 6 5 см Волькерт и Фиерс описали и метод двумерного фракционирования олигонуклеотидов ионообменной ТСХ на этих же пластинках. В столь кислой среде почти все остатки аденина заряжены положительно, поэтому при любом числе звеньев суммарный электрический заряд цепочки адениловых остатков ( Ар) в первом приближении равен нулю. Тем более не вносит заряда и остаток цитидиловой кислоты. Таким образом все олигонуклеотиды вида ( Ар) пСр, будучи не заряжены, не участвуют в ионном взаимодействии с PEI и, следовательно, должны мигрировать вместе с фронтом элюента. [49]
 |
Схематическое изображение последовательных стадий. [50] |
Для существенного улучшения эффективности разделения и параметров количественной оценки используют предварительное разделение. Полученную промежуточную кольцевую зону сравнительно малого диаметра затем разделяют основным элюентом. На обычных пластинках со слоем силикагеля эту операцию проводят с элюентами, достаточно полярными для разделения всех присутствующих компонентов, или в случае использования системы с обращенными фазами применяют достаточно неполярные элюенты. Его вводят в центр пластинки на слой сорбента, расположенного сверху подложки, пипетками Барольера или капиллярами. При этом фронт элюента продвигается через нанесенные пятна проб на расстояние 1 - 2 мм. В случае когда не все компоненты анализируемой смеси продвигаются вместе с фронтом растворителя - а так чаще всего и бывает па практике - предварительное разделение проводят несколько раз, следя за тем, чтобы длина пути разделения была постоянной. [51]
Для ТСХ-разделения большинства аминокислот их количество в пробе должно быть 0 5 - 1 мкг. Для получения компактных зон аминокислот следует постепенно наносить пробу объемом 1 мкл пипеткой, добавляя следующую порцию раствора после высушивания предыдущей. Если основанием пластинки считать более короткую сторону, то концентрат следует наносить в правый угол на расстоянии 1 5 см от краев. После того как фронт элюента продвигался на 20 см, пластинку высушивали в токе воздуха в течение 15 мин и затем выдерживали в сушильном шкафу при температуре 60 С в течение 20 мин. После того, как хроматограм-ма остывала, проводили разделение во втором направлении при 90 С смесью н-бутилового спирта, уксусной кислоты и воды ( 60: : 20: 20 по объему), содержащей 0 2 % ( об.) нингидрина. Когда фронт растворителя поднимался на 18 см, пластинку вынимали из камеры, высушивали в сушильном шкафу при температуре 60 С в течение 30 мин до окрашивания пятен. На расстоянии приблизительно 3 см от нижнего края трубки имеется сужение, в котором укреплена пробка - фильтр из стекловолокна, другой конец трубки соединен с вакуумным насосом. [52]
Пробу воды 100 мл помещают в плоскодонную термостойкую колбу вместимостью 250 мл, подкисляют азотной кислотой и упаривают досуха. Соответствующие ( по 10 мл) объемы стандартных растворов упаривают и обрабатывают так же, как и пробу. Рекомендуется пробу анализируемого раствора с содержанием катионов 3 - 5 мкг и стандартную наносить на одну пластинку, так чтобы исходные пятна не превышали в диаметре 7 мм. Насыщение камеры проводят в течение часа с использованием листов фильтровальной бумаги, смоченных элюентом. Разделение проводят до тех пор, пока фронт элюента не продвинется на 13 см. Большинство органических веществ не мешает определению. После высушивания пластинки ее опрыскивают 2 0 % - ным этанольным раствором 8-оксихинолина. [53]
Этого краткого описания ( ниже оно будет развернуто) достаточно для того, чтобы отметить два принципиальных отличия ТСХ от колоночной хроматографии. Во-первых, жидкий элюент мигрирует по слою сухого носителя, смачивая его - это необходимо для обеспечения действия капиллярных сил. Отсюда следует, что формирование неподвижной жидкой фазы внутри и на поверхности гранул носителя происходит за счет элюента в ходе самого хроматографического процесса. Во-вторых, одна из поверхностей тонкого слоя пористого носителя остается открытой и с нее может идти испарение элюента. Оба отличия играют немаловажную роль как в понимании процесса ТСХ, так и в разработке методов его практической реализации, чему уделено соответствующее внимание в последующих разделах. Что же касается того обстоятельства, что поперечное сечение носителя является не кругом, а очень тонкой и длинной полоской, то оно не играет принципиальной роли в протекании хроматографического процесса при условии, что диаметр гранул мал по сравнению с шириной полоски, а слой носителя однороден и имеет везде одинаковую толщину, так что фронт элюента продвигается с одной и той же скоростью по всей ширине пластинки. [54]
Легко видеть, что хроматографцческая ситуация при ТСХ сложнее, чем при колоночной, где элюцию можно вести объемами, во много раз превышающими свободный объем колонки, а фракции выходят одна за другой, иногда с большими интервалами. Здесь же все пятна или полосы должны распределиться по длине пластинки за время прохождения всего лишь одного свободного объема слоя сорбента. Движение элюента обусловлено смачиванием сухого сорбента, поэтому после достижения передним фронтом элюции края пластинки хроматографический процесс автоматически прекращается и все пятна компонентов смеси остаются на пластинке. Правда, если все они мигрируют медленно, то объем элюции можно увеличить. Конец фитиля можно выпустить из хро-матографической камеры, давая возможность жидкости с него испаряться - в этом случае объем элюции может быть любым. Конец фитиля, если нужно, можно обдувать подогретым воздухом. Иногда из камеры выпускают конец самой пластинки и подогревают его. Второй вариант увеличения объема элюции состоит в том, что после достижения фронтом элюента края пластинки ее вынимают из камеры и высушивают, а затем возвращают в нее для повторной элюции. Кстати, это позволяет при необходимости изменить состав элюента при повторном проявлении. Увеличение объема элюции позволяет воспользоваться менее эффективными элюента-ми и тем самым увеличить значения коэффициентов распределения компонентов смеси в пользу неподвижной фазы, что, как было показано в гл. [55]
Хроматографическая бумага должна быть чистой, однородной по плотности, структуре и ориентации волокон. Обычная бумага гидрофильна и содержит до 20 % влаги, что является вполне достаточным количеством в том случае, когда НФ служит вода, а ПФ - несмешивающийся с. В этом случае бумагу предварительно пропитывают гидрофобным. Подвижной фазой в обращенно-фазовом варианте служат вода и смеси воды с полярными органическими растворителями. В хроматографии на бумаге, как и в других видах хроматографии, большое значение имеет правильный выбор неподвижной и подвижной фаз. Используемые фазы не должны смешиваться друг с другом. Анализируемые вещества должны растворяться в НФ лучше, чем в ПФ, иначе они будут двигаться со скоростью движения фронта элюента. В настоящее-время в качестве ПФ индивидуальные растворители используют, как правило, редко. Чаще применяют смеси эмпирически подобранных компонентов. Хроматограмма аналогична полученной в методе ТСХ и имеет вид пятен более или менее отделенных друг от друга. Для проявления пятен пригодны методы, описанные для ТСХ. [56]
Страницы: 1 2 3 4