Cтраница 3
Использование химотрипсина имеет такие же ограничения, как и использование трипсина. [31]
Связывание химотрипсина осуществляют из 1 5 % - ного раствора в 0 5 М боратном буфере ( рН 8 75) при 23 С; через 4 5 ч получают продукт, содержащий 19 мг фермента в 1 г препарата с сохранением 70 % ферментативной активности. [32]
Связывание химотрипсина и глицина на сферонах семи типов приведено в табл. 8.1. Гели образуют правильные сферические гранулы и различаются по химической и физической стабильности. Они хорошо выдерживают хроматографию под давлением и не меняют свою структуру после 8-часового нагревания при 150 С в 1 М растворе гликолата натрия или после 24-часового кипячения в 20 % - ной соляной кислоте. Они биологически инертны и, подобно акриламидным гелям, не атакуются микроорганизмами. [33]
Инкубирование химотрипсина с эфирами аминокислот ведет как к гидролизу, так и к образованию растворимых и нерастворимых пептидов соответствующих аминокислот. [34]
Расщепление модифицированного химотрипсина и выделение пептидов, содержащих фосфосериы, показало, что последовательности асп - сер - гли - глу - ала - вал и гли - асп - сер - гли - гли - про - лей входят в состав активного центра. Последовательность гли - асп - сер - гли имеется в трипсине и в химотрипсине. [35]
Расщепление модифицированного химотрипсина и выделение пептидов, содержащих фосфосерин, показало, что последовательности асп - сер - тли - глу - ала - вал и гли - асп - сер - гли - гли - про-лей входят в состав активного центра. Последовательность гли-асп-сер - гли имеется в трипсине и в химотрипсине. [36]
Катализируемая химотрипсином элиминация дипептида треониласпараги-новой кислоты от б-химотрипсина дает а-химотрипсин. Тот же продукт может получиться при обратном порядке отщепления дипептидов; в качестве промежуточного продукта в этом случае образуется неохимотрипсино-ген. [37]
В химотрипсине ( фермент группы гидролаз) каталитическое действие осуществляют три группы - имидазольная, гидроксиль-ная и карбоксильная. Альдолаза катализирует конденсацию фосфорных эфиров диоксиацетона и глицеринового альдегида при участии двух групп - е-аминогруппы остатка лизина и имидазоль-ной группы. Специфичность действия ферментов зависит от строения белка в целом и от особенностей белковой молекулы вблизи активного центра. [38]
Трипсин и химотрипсин, очевидно, имеют второй активный центр, содержащий гистидин. Второй участок удален от первого, но на спиральной цепочке они сближены. Установление активной роли гистидина основывалось частично на изменении скорости ферментативной реакции в зависимости от рН, что соответствовало предположению о стратегическом расположении слабоосновного остатка, имеющего характер гистидина. То, что фермент в 105 раз эффективнее, чем имидазол, имеет аналогию в модельных опытах по мутаротации глюкозы - реакции, катализируемой кислотами и основаниями. И в а-окси-пиридине, и в протеолитических ферментах бифункциональность повышает каталитическую активность, поскольку протоны могут быть одновременно поданы и отщеплены в сопряженной реакции. Механизм действия, предложенный Нейратом ( 1957) для химотрипсина, сводится к следующему. При взаимодействии гидроксильной группы серина с имидазольным кольцом гистидина отщепляется протон и образуется активированный комплекс II, имеющий элактрофилыный и нуклеофиль-ный центры. [39]
Сильно ингиби-руег химотрипсин, слабо папаин и ка-тепсин, неактивен к трипсину. Вызывает 50 % - ное ингибирование при следующих конц. Лейцин в составе молекулы может быть заменен на изолейцин или валин. [40]
Трипсин, химотрипсин и элаетаза максимально активны rif слабощелочной реакции среды. [41]
Аналогично трипсину химотрипсин обычно медленно гидролизует связи, расположенные в непосредственной близости от свободных а-амино - и а-карбоксиль-ных групп. Наличие рядом с атакуемой химотрипсином связью отрицательного заряда ( Glu, Asp, CMCys ( карбокснметилцистеин), CysSO H ( цистеиновая кислота) существенно снижает скорость гидролиза, а присутствие основных аминокислот ( Lys и Arg увеличивает степень расщепления. Чрезвычайно затруднен гидролиз пептидных связей, образованных нмнногруппон пролнна. [42]
Термолизин и химотрипсин обычно служат инструментом для дополнительной фрагмеитвции крупных пептидов - продуктов химического или ферментативного гидролиза белка. В то же время довольно часто они применяются и для первичного расщепления белков небольшой и средней молекулярной массы с целью получения пе ре к ры веющихся фрагментов. [43]
Трипсин и химотрипсин, очевидно, имеют второй активный центр, содержащий гистидин. Второй участок удален от первого, но на спиральной цепочке они сближены. Установление активной роли гистидина основывалось частично на изменении скорости ферментативной реакции в зависимости от рН, что соответствовало предположению о стратегическом расположении слабоосновного остатка, имеющего характер гистидина. То, что фермент в 105 раз эффективнее, чем имидазол, имеет аналогию - в модельных опытах по мутаротации глюкозы - реакции, катализируемой кислотами и основаниями. И в а-окси-лиридине, и в протеолитических ферментах бифункциональность повышает каталитическую активность, поскольку протоны могут быть одновременно поданы и отщеплены в сопряженной реакции. Механизм действия, предложенный Нейратом ( 1957) для химотрипсина, сводится к следующему. При взаимодействии гидроксильной группы серина с имидазольным кольцом гистидина отщепляется протон и образуется активированный комплекс II, имеющий электрофильный и неуклеофиль-ный центры. [44]
Так, химотрипсин и прокарбоксипеп-тидаза активируются трипсином; трипсиноген - также трипсином или энтеропептидазой; пепсиноген - пепсином или ионами водорода ( при подкислении среды); прореннин - ионами водорода. Процесс, естественно, имеет автокаталитический характер и скорость его стремительно нарастает. [45]