Аффинная хроматография
Cтраница 4
Серьезным ограничением использования аффинной хроматографии в системах с высоким сродством ( напри-мер, гормон-рецептор-ные взаимодействия) и для выделения пико - и наномольных количеств белков является относительно легкое отщепление аффинных лигандов в раствор. Эти аффинные лиганды связаны преимущественно монофункционально с активированной бромцианом сефарозой через пространственную группу. Механизм отщепления аффинных лигандов, связанных с активированной бромцианом сефарозой, в присутствии соединений, содержащих нуклеофиль-ные группы, обсуждался в разд. [46]
Влияние температуры в аффинной хроматографии обсуждалось в разд. [48]
Для успешного проведения аффинной хроматографии необходимо не только связывание аффинного лиганда, но и полное удаление всего аффинного лиганда, нековалентно связанного с носителем. Поэтому соединения следует тщательно промывать, контролируя результаты промывки. Сорбированные ароматические соединения можно успешно удалить с помощью органических растворителей, а для удаления белков полезна промывка денатурирующими агентами, если они не влияют на носитель и на связывающую способность аффинного лиганда. Необходимо быть уверенным в том, что измеряемая биологическая активность специфического адсорбента действительно обусловлена только ковалентно связанным аффинным лигандом. С этой целью определяют изменение концентрации нерастворимого производного после инкубирования в различных буферных растворах или после других подходящих обработок сорбента. [49]
В основе принципа аффинной хроматографии лежит отличительная особенность биологически активных веществ образовывать стабильные, специфические и обратимые комплексы. Если иммобилизовать один из компонентов комплекса, то получится специфический сорбент для второго его компонента, при этом, разумеется, предполагается, что соблюдаются все условия, необходимые для образования этого комплекса. Связывающие участки иммобилизованных веществ должны сохранять хорошую стерическую доступность для второго участника комплекса даже после связывания с нерастворимым носителем и не должны деформироваться. Методы, созданные для присоединения антигенов и антител к нерастворимым носителям, были сразу же применены для получения иммобилизованных ферментов. [50]
Основное требование для успешной аффинной хроматографии состоит в том, что образование комплекса макромолекулярного вещества с аффинантом, ковалентно связанным с нерастворимым носителем, адекватно образованию их комплекса в растворе. Это требует прежде всего достаточного пространства, в особенности если речь идет о взаимодействиях высокомолекулярных веществ. Отсюда одним из наиболее важных требований, предъявляемых к нерастворимым носителям, является высокая пористость. [51]
Согласно Катрекасасу [71], аффинная хроматография представляет собой метод выделения вещества или группы веществ на основании сродства к какому-либо лиганду, причем это сродство отражает биологические функции исследуемого вещества. В общем виде этот метод был рассмотрен в гл. Поскольку выделению ферментов посвящена гл. [52]
Основной предпосылкой для проведения аффинной хроматографии является образование специфического комплекса EL между выделяемым ферментом Е и аффинным лигандом L, связанным с нерастворимым носителем. [53]
Для успешного применения метода аффинной хроматографии необходимо иметь представления о свойствах как нерастворимых носителей, так и иммобилизованных аффинных лигандов. Одними из основных свойств, определяющих возможность использования нерастворимых носителей для целей аффинной хроматографии, являются сорбционные. Для связывания аффинного лиганда важно количество активируемых или активных групп, способных присоединить молекулы аффинного лиганда. Число групп, которые могут быть использованы для иммобилизации, часто оценивается на основе данных о присоединении низкомолекулярных веществ, например глицина или гли-циллейцина, к эпоксиактивированным гелям. Некоторые методы определения содержания этих веществ описаны в разд. Из табл. 8.1, в которой приведены количества глицина и химотрипси-на, присоединенных к различным типам сферона, видно, как важно принимать во внимание размер иммобилизуемых молекул и площадь поверхности нерастворимого носителя. [54]
Важным условием успешного проведения аффинной хроматографии является выбор подходящего нерастворимого носителя для получения сорбента. [55]
Например, применяя метод аффинной хроматографии, можно провести высокоспецифичное одностадийное выделение нужных веществ из очень сложных природных смесей. [56]
 |
Кинетика аффинного связывания лактатдегидро-геназы на 5 - АМР-сефарозе [ Turkova, 1978 ]. [57] |
Даже при статическом варианте аффинной хроматографии не рекомендуется использовать более 15 - 25 % эффективной емкости колонки для данного вещества. Под эффективной удельной емкостью сорбента условимся понимать максимальное количество вещества, например белка, которое может связаться с ним ( в расчете на 1 мл) при перемешивании в свободном объеме за достаточное для установления равновесия время, так что в жидкой фазе концентрация этого вещества будет оставаться практически нулевой. [58]
Приемы, используемые в аффинной хроматографии, в основном те же, что и в других рассмотренных выше методах, поэтому достаточно будет остановиться лишь на некоторых отличительных особенностях. Уже упоминалось, что в большинстве случаев решается задача аффинной очистки одного вещества, сила связывания которого на сорбенте намного превосходит силы неспецифической сорбции других компонентов исходной смеси. Это позволяет эффективно использовать аффинную хроматографию и на ранних стадиях очистки вещества. Нередко на этой стадии в препарате могут содержаться выпавшие в осадок белки или липопротеиды, способные забивать колонку. [59]
Есть еще одна особенность аффинной хроматографии, которую следует отметить с самого начала. Способ связывания биологически активного лиганда с матрицей обязан не только обеспечивать сохранение его активности, но и не создавать стерических препятствий для взаимодействия сорбируемого вещества с лигандом. Когда в качестве лпганда выступает биополимер ( белковый антиген или субстрат, нуклеиновая кислота) и его участок биоспецифического взаимодействия оказывается достаточно удаленным от точки закрепления на матрице, то эта проблема не возникает. [60]
Страницы: 1 2 3 4