Cтраница 4
Гель-фильтрация является наиболее мягким способом фракционирования целлюлаз. Метод наиболее эффективен для отделения целлобиаз, имеющих значительно более высокую молекулярную массу, чем эндоглюканазы и целлобиогидролазы, или низкомолекулярных эндоглюканаз с молекулярной массой менее 20000 Да. Недостатком метода является многократное увеличение объема наносимых образцов в ходе элюции, что требует последующего концентрирования, длительность процесса. [46]
Резюмируя материал по традиционным способам очистки целлюлаз, следует отметить, что набор данных методов позволяет за 3 - 5 стадий получить гомогенные по данным изоэлектрического фокусирования и электрофореза компоненты целлюлазного комплекса. Эта задача решается сравнительно легко, если требуется выделить и очистить одну или несколько основных множественных форм. Однако она становится часто неразрешимой при получении в высокоочищенном состоянии всех множественых форм целлюлаз, полного фракционирования комплекса как в силу высокой трудоемкости ( несколько месяцев), так и за счет принципиальной невозможности разделения некоторых близких по всем биохимическим параметрам множественных форм, крайне низких ( 5 - 10 %) выходов ферментов. [47]
В отличие от традиционных способов очистки целлюлаз, схемы тонкого фракционирования и получения индивидуальных ферментов для решения задач сравнительной характеристики множественных форм, изучения их роли в катализе должны быть дортаточ-но универсальны, т.е. пригодны для выделения индивидуальных компонентов из различных источников, должны позволять быстро и количественно получать те или иные изоферменты целлюлаз, включая минорные. Данным требованиям во многом отвечают способы очистки, основанные на быстро развивающихся методах ВЭЖХ белков. При этом освоение ведущими фирмами мира ( Bio-Rad, LKB, Pharmacia и др.) выпуска широкого спектра носителей для ВЭЖХ белков позволяет использовать для очистки целлюлаз такие виды хроматографии, как гель-проникающая, ионообменная, адсорбционная на гидрофобных носителях и гид-роксилапатите, хроматофокусирование. Это позволяет практически без изменений использовать ранее разработанные схемы получения множественных форм целлюлаз в высокоэффективном варианте. [48]
Все эти методы характеризуются высокими выходами целлюлаз из микробных источников, позволяют за 2 - 3 стадии полностью очистить культу-ральную жидкость от низкомолекулярных продуктов метаболизма, полностью депигментировать раствор, в 5 - 10 раз поднять уровень удельной активности ферментов. [49]
Гидролиз этих отходов проводится с использованием целлюлаз. [50]
Рассмотрим более детально практическое значение ферментов целлюлаз и характер их использования. [51]
Для целей концентрирования и групповой очистки целлюлаз активно используются дробное осаждение сульфатом аммония, этанолом, другими органическими растворителями. [52]