Гель - агароза
Cтраница 4
В заключение ограничимся упоминанием ( поскольку он еще дальше отстоит от аффинной хроматографии) метода аффинного электрофореза. Суть его состоит в том, что в ПААГ или гель агарозы занолимеризотшватот ( часто в ограниченном слоо геля) аффинный сорбент для определенного белка или же химически связывают с гелем аффинный лигагщ. Когда в пластине или трубке такого геля ведут электрофорез смеси белков, то компоненты смеси, обладающие сродством к сорбенту или лиганду, задерживаются благодаря аффинному взаимодействию, что облегчает их отделение или идентификацию. Этот прием уже был рассмотрен в предыдущей книге данной серии при описании перекрестного иммуноэлектрофореза. [46]
Фирмы LKB ( Швеция) и IBF ( Франция) выпустили сорбент под названием Llltrogel НА, в котором кристаллический окспапа-тит ( 40 о по массе) заплавлен внутри сферических ( 60 - 180 мкм) гранул 4 -ной химически сшитой агарозы. Впрочем, при работе с макромолекулами из-за замедленной диффузии в геле агарозы приходится ограничиваться гораздо меньшей скоростью. ДНК с молекулярной массой более 5 - Ю6 в такую агарозу вообще практически не диффундирует, но для очистки молекул меньшего размера, например ДНК плазмнд, этот сорбент очень удобен, поскольку о его прочности беспокоиться не приходится. [47]
 |
Жидкостной микроколоночный хроматограф Мнллихром ( СССР, ПО Научприбор, г. Орел.| Разделение тиолсодержащих и тнолнесодержащих пептидов ковалснт-ной хроматографией. [48] |
Для селективного выделения пептидов можно использовать иммуносорбеиты, представляющие собой антитела, ковалентно присоединенные к нерастворимому полимеру-носителю. Среди последних нашли распространение носители на основе производных бром-ацетил целлюлозы и гелей агарозы с ковалентно присоединенными антителами к 2 4-динитрофенолу. Такие носители применяются для выделения функционально важных пептидных фрагментов, содержащих реакционноепособные аминокислотные остатки после их селективного динитрофеиилирования. Разработаны методики присоединения 2 4-динитрофеннльной группы к остаткам цистеина, метионина, лизина и триптофана. [49]
Обработанные таким образом матрицы иногда называют эпокси-активированными. Концевая эпоксигруппа может иногда ( при благоприятных стерических условиях) связаться с другой нитью геля агарозы, что приводит к повышению термостойкости эпокси-активированной сефарозы за счет некоторого снижения ее пористости. Вместо бмс-оксирана для получения эпокси-активированной полисахаридной матрицы можно воспользоваться эпихлоргпд-рином. [50]
Как видно из представленных данных, сефакрилы пригодны для фракционирования или очистки крупных макромолекул, но не могут заменить сефадексы малых номеров, пригодные для работы с относительно низкомолекулярными объектами. Как будет видно из сопоставления с данными, приведенными ниже, сефакрилы могут успешно конкурировать с гелями агарозы. Пористость сефакрила S-1000 Superfine - примерно такая же, как у 0 5 % - ной агарозы, а сефакрила S-400 Superfine - как у 5 % - ной. [51]
Приведенные примеры ясно показывают, что тонкослойная гель-фильтрация в сочетании с иммунной преципитацией является простым и удобным методом, который может дополнить иммуноэлектрофорез при идентификации белков в биологических жидкостях или при выделении белков. В случае необходимости чувствительность и разрешение метода можно повысить, выполняя электрофорез после тонкослойной гель-фильтрации в геле агарозы, содержащем антитела. [52]
Фирма Bio-Rad выпускает готовые аффинные сорбенты ( типа Affi-Gel) на основе как обычной, так и химически сшитой агарозы. В подавляющем большинстве готовых аффинных сорбентов фирм PL-biochemicals, Sigma и Pierce ( кроме Agarose-Blue) используется несшитый 4 % - ный гель агарозы. Фирмы LKB ( Швеция) и IBF ( Франция) также используют в качестве матриц обычную и химически сшитую агарозу под названиями Ultrogel А и Ultrogel AR соответственно. Они ( особенно IBF) широко используют смешанные матрицы типов Ultrogel АсА 22 и Ultrogel АсА 34 с посадкой лигандов по амидным группам акриламида. Напомним, что первая цифра в этих наименованиях означает процентное содержание акрпламида, а вторая - агарозы. [53]
Фракционирование займет меньше времени, а разрешение пиков от этого выиграет; кроме того, улучшатся условия для сохранения биологической активности. Ультрогели серии АсА, а также сефадексы и биогели серии Р средней и крупной пористости могут в этом плане оказаться наиболее подходящими матрицами, так как пределы исключения для них ниже, чем у других сефадексов и гелей агарозы. [54]
Агароза очень гидрофильна, а ее полимерные нити еще в большей степени, чем нити целлюлозы, склонны к образованию водородных связей. Благодаря этому горячий 2 - 6 % - ньтй раствор агарозы застывает в виде жесткого и очень крупнопористого геля. При температуре около 100 гель агарозы плавится, поэтому его нельзя автоклавировать; в случае необходимости гель приходится стерилизовать раствором диэтилпирокарбоната. Модификация агарозы может происходить также по гид-роксильным группалг. [55]
После затвердения агара в нем вырезают канавки, которые заполняют соответствующей иммунной сывороткой. Более поздняя модификация метода [9] позволяет проводить количественный иммун-нохимический анализ разделенных в тонком слое еефадекса фракци. По окончании гель-фильтрации слой сефадекса покрывают пластинкой геля агарозы, содержащего соответствующие антитела. В результате взаимодействия фракционированных белков с антителами образуются кольца преципитации, подобные тем; которые наблюдаются при радиальной иммунодиффузии. [56]
По-видимому, полиакриламидные гели, введенные в употребление Хьертеном. Мосбахом [2], обладают аналогичными свойствами. Дальнейшее расширение возможностей метода связано с созданием сферических гелей агарозы различной пористости [3] ( см. разд. [57]
К настоящему времени накоплен определенный опыт работы на сефадексах G-25, G-200, но совершенно нет данных относительно использования G-10 и G-15. Так, он показал, что на био-геле Р-300 достигается лучшее разделение фер-ритина, чем на сефадексе G-200. Особенно интересно расширить область применения тонкослойной гель-фильтрации путем освоения гелей агарозы. [58]
Страницы: 1 2 3 4