Cтраница 4
Главное отличие зонного электрофореза от фронтального состоит в том, что при зонном электрофорезе используется поддерживающая среда, в которой осуществляется движение вещества, тогда как при фронтальном электрофорезе ионы свободно перемещаются в растворе. Поддерживающей средой, или носителем, служат обычно бумага, целлюлоза, крахмальные гели или блоки, пористые полиуретаны и полиакрил-амидные гели. [46]
Крахмал суспендируют в 270 мл буферного раствора, предназначенного для геля, в котором растворено 40 0 г мочевины. Все остальные процедуры проводят так же, как и при обычном горизонтальном электрофорезе в крахмальном геле ( стр. [47]
Спустя два года Линдквист и Сторгардс [185] опубликовали данные по фракционированию аминокислот и пептидов на колонках с крахмальным гелем и объяснили полученные результаты на основе эффекта молекулярных сит. В том же 1955 г. Лейт и Рутвен [167, 186] провели фракционирование смесей различных белков и меньших по размеру молекул на колонках с крахмальным гелем. Они первыми осуществили фракционирование образцов, молекулярные веса которых изменялись в широких пределах, и объяснили полученные данные на основании ограниченной проницаемости фракционируемых молекул в гели в зависимости от размеров этих молекул. Эти авторы далее показали, что область молекулярных весов фракционируемых молекул можно было значительно расширить путем набухания гранул крахмала и увеличения размеров пор в этих гранулах. [48]
Электрофорез в крахмальном геле имеет не только большое значение при диагностике парапротеинемий: он весьма важен при определении гомогенности нативных белков и полезен при анализе субъединичной структуры молекулы белка. Например, папаиновые фрагменты IgG ( Fab, Fc и Fc) или выделенные из него полипептидные цепи ( Н - и L-цепи) при электрофорезе в крахмальном геле образуют отдельные зоны. Это позволяет сравнивать субъединицы гомогенных IgQ ( миеломных белков или чистых антител) между собой. [49]
Используя окрашенный бумажный отпечаток, отмечают границы каждой фракции на крахмальном блоке. Каждый фрагмент крахмального геля отдельно суспендируют в 10 мл холодной дистиллированной воды, частицы крахмала осаждают центрифугированием при 2000 об / мин и в надоса-дочной жидкости определяют содержание белка. [50]
Некоторые методические сложности препятствуют широкому распространению электрофореза в крахмальном геле, несмотря на его весьма большую разрешающую способность. По сравнению с электрофорезом на бумаге электрофорез в крахмальном геле включает дополнительные операции, связанные с приготовлением и гидролизом крахмала, сборкой прибора, окрашиванием и количественным определением полученных фракций. Однако присущий крахмальному гелю эффект молекулярного сита увеличивает разрешающую способность данного метода по сравнению с электрофорезом на бумаге, и поэтому его используют для более тонкого анализа. [51]
Для препаративного выделений зон с поверхности геля сначала срезают тонкий слой, в котором определяют положение компонентов. В соответствии с этим зоны вырезают из оставшейся части геля. Если заморозить и оттаять кусочки крахмального геля, последний приобретает губчатую структуру и жидкость из него можно просто выдавить или извлечь центрифугированием. Чтобы избежать возможной адсорбции на поверхности твердой фазы, рекомендуется производить эту операцию по возможности быстро. [52]
Для препаративного выделения зон с поверхности геля сначала срезают тонкий слой, в котором определяют положение компонентов. В соответствии с этим зоны вырезают из оставшейся части геля. Если заморозить и оттаять кусочки крахмального геля, последний приобретает губчатую структуру и жидкость из него можно просто выдавить или извлечь центрифугированием. Чтобы избежать возможной адсорбции на поверхности твердой фазы, рекомендуется производить эту операцию по возможности быстро. [53]