Cтраница 1
Белковый гидролизат пропускается через колонку Н - или ГШ4 - обменного адсорбента до тех пор, пока не будет обнаружен проскок основных аминокислот в фильтрат. Эта стадия процесса соответствует получению так называемой первичной хроматограммы. Таким способом можно сконцентрировать в колонке аргинин, гистидин и лизин. Однако после пропускания белкового гидролизата и промывания колонки водой оказывается, что в колонке катионообменной смолы адсорбируются также нейтральные моноаминомонокарбоновые кислоты. Причины этого явления пока не изучены. Адсорбция лейцина, изолейцина, валина, тирозина, фенилаланина и пролина, возможно, носит молекулярный характер. При этом можно ожидать, что некоторые аминокислоты, например тирозин, цистин и лейцин, будут осаждаться в колонке. Адсорбированные в катионообменной колонке аминокислоты вытесняются растворами 5 % H2S04, 7 % HCl, 20 % НС1 или NH4OH ( 4 % NH3), а также другими растворами оснований и солей. Если катионообменная колонка обрабатывается водным пиридином или другими слабыми основаниями, то первыми будут вытесняться моноаминокислоты, а затем весь гистидин. [1]
Белковый гидролизат пропускается через колонку Н - или МН4 - обменного адсорбента до тех пор, пока не будет обнаружен проскок основных аминокислот в фильтрат. Эта стадия процесса соответствует получению так называемой первичной хроматограммы. Таким способом можно сконцентрировать в колонке аргинин, гистидин и лизин. Однако после пропускания белкового гидролизата и промывания колонки водой оказывается, что в колонке катионообменной смолы адсорбируются также нейтральные моноаминомонокарбоновые кислоты. Причины этого явления пока не изучены. Адсорбция лейцина, изолейцина, валина, тирозина, фенилаланина и пролина, возможно, носит молекулярный характер. При этом можно ожидать, что некоторые аминокислоты, например тирозин, цистин и лейцин, будут осаждаться в колонке. Адсорбированные в катионообменной колонке аминокислоты вытесняются растворами 5 % HaS04, 7 % НС1, 20 % НС1 или МН4ОН ( 4 % NH3), а также другими растворами оснований и солей. Если катионообменная колонка обрабатывается водным пиридином или другими слабыми основаниями, то первыми будут вытесняться моноаминокислоты, а затем весь гистидин. [2]
Белковый гидролизат, не содержащий аммиака, разбавляют до 300 мл, нейтрализуют и добавляют 6 мл концентрированной НС. Оставляют стоять для образования осадка при комнатной температуре ( 23 - 25) на 48 час. [3]
Белковый гидролизат окисляют в нейтральной или слабощелочной среде периодной кислотой. Образующийся при окислении треонина ацетальдегид отгоняют током воздуха. Образовавшийся из серина формальдегид удерживается в растворе аминогруппами остальных аминокислот. [4]
Нейтральный белковый гидролизат окисляют Са ( МпО4) г. После удаления осадка осаждают гуанидин из нейтрального раствора пикратом натрия. [5]
Анализ белковых гидролизатов проводят следующим образом. Утром включают анализатор, нагревают до рабочей температуры термостат и баню реактора, готовят буферные растворы и реагенты. При этом вначале удаляют из колонки избыток буферного раствора, а затем пипеткой с тонким концом осторожно ( по стенке) вводят раствор образца. Впитывание образца проводят при избыточном давлении газа ( азот или воздух) 0 3 атм. По установлении рабочего давления определяют скорость потока в системе. Через час включают насос подачи нингидринового реагента. К этому времени все кислые и нейтральные аминокислоты уже элюированы из колонки. После установления рабочего давления определяют скорость потока и включают самописец. [6]
Аминокислоты белковых гидролизатов разделяют на колонке 0 9x150 см в две стадии. В соответствии с константами диссоциации тирозин и фенилаланин должны элюироваться в меньших объемах; их задержка объясняется адсорбцией на матрице ионита. Основные аминокислоты элюи-руются с большой задержкой, ускорить их выход можно лишь существенным увеличением концентрации буфера. Однако это в свою очередь вызывает дрейф нулевой линии, изменение объема смолы и ряд других отрицательных последствий. Поэтому элюирование заканчивают, а оставшиеся аминокислоты вымывают разбавленным раствором гидроокиси натрия. При этом вначале получают суммарный пик кислых и нейтральных аминокислот, а затем в области между триптофаном и аргинином элюируют основные аминокислоты. [7]
Состав белковых гидролизатов не всегда ограничивается генетически кодированными аминокислотами: теперь точно установлено, что тироксин н 3 3 5-трннодтнронин являются двумя тнроид-ными гормонами, а химическая или тепловая обработка, предшествующая гидролизу, могут приводить к артефактам. Необычные аминокислоты, возникающие в физиологических условиях, могут быть разделены на две группы. Все изменения, по-видимому, являются следствием индуцируемых ферментами реакций, а введенными заместителями, в основном, оказываются С-гидроксил, yV - метил боковой цепи или галоген в ароматическом ядре тирозина. [8]
Для анализа белковых гидролизатов разработаны очень удобные хроматографические методы. Тем не менее электрофорез, особенно электрофорез на бумаге, очень часто применяют, когда смеси не очень сложны и когда имеющиеся в смеси аминокислоты значительно отличаются по кислотно-основным свойствам. Электрофоретическое разделение аминокислот можно провести очень быстро, особенно если применить высоковольтный электрофорез. Проявление электрофореграмм осуществляют с помощью нингидрина. [9]
Разделение компонентов белкового гидролизата методами хроматографии основано на том, что у различных аминокислот неодинаковы коэффициенты распределения между водой и, растворителем, не смешивающимся с водой, но частично в ней растворяющимся. В качестве водной, или так называемой неподвижной фазы могут служить кизельгур, целлюлоза, си-ликагель и фильтровальная бумага, поры и капилляры которых содержат определенное количество воды. Поддерживающая среда может служить в качестве инертного носителя или играть известную роль в адсорбции веществ, подлежащих разделению. [10]
Одноколоночный анализ белковых гидролизатов и физиологических жидкостей проводят по единой схеме на колонке 0 9 X Х133 см при 60 С. Поскольку элюирова-ние ведут в градиенте буфера, используют нингидриновый реагент с большей буферной емкостью. [11]
Определенная часть белкового гидролизата, содержащая 1 - 4 мг фенилаланина, упаривается досуха. Добавляют 2 мл 10Т раствора КМОз в концентрированной Й25О4 и нитруют в течение 20 мин. Остаток растворяют в 9 мл воды. Раствор подщелачивают аммиаком, охлаждают и вносят 0 5 мл свежеприготовленного 1 % раствора аскорбиновой кислоты. Разбавляют концентрированным аммиаком до 25 мл. [12]
Для каждого белкового гидролизата необходимо сперва установить оптимальные условия определения. [13]
Несколько сот граммов белкового гидролизата, очищенного от гуминов и соляной кислоты, фильтруют через колонку с активированным углем, удаляя, таким образом, тирозин и фенилаланин. Обе аминокислоты вытесняют смесью фенол-уксусная кислота. Гидролизат разбавляют до 40 л ( рН 1 86) и фильтруют со скоростью подачи 40 мл / мин через систему последовательно соединенных колонок. [14]
На 5 мл белкового гидролизата с содержанием от 2 до 10 мг пролива вводят l / H. [15]