Cтраница 3
Некоторые ферменты катализируют в биологических систе - мах перенос различных группировок с одного вещества на другое в процессе разнообразных трансформаций органических веществ; такие ферменты носят название трансфера. Сюда относятся переносчики метильных групп ( метилтранс феразы), различных ацильных групп ( ацилтрансферазы) г фосфатных группировок ( киназы) и др. Особое значение имеют трансаминазы, с помощью которых осуществляется превращение различных кетокислот в аминокислоты и обратно. [31]
С 1 моль фермента прочно связаны 2 моль пиридоксаль-5 - фосфата. Однако в отличие от фермента из мышц в ферменте из картофеля отсутствует серинфосфат, который является активным центром фосфатазы фосфорилазы и киназы: кроме того, для этого фермента не требуется АМФ в качестве кофактора процесса активации. В связи с этим интересно отметить, что из водоросли Oscillatoria princeps [63] выделены две формы фосфорилазы, причем одна из них нуждается в АМФ. [32]
Отдельные очень важные классы бионеорганических соединений рассмотрены в книге достаточно подробно. К таким соединениям можно отнести еидерохромы, различные ионофоры, ферри-тин, трансферрины, церулоплазмин, гемэритрин, гемоцианин, кар-боксипептидазы и карбоангидразу, киназы, оксидазы, ферредокси-ны, гемоглобин и миогло бин, цитохромы b и с, цитохромоксидазы, пероксидазы и каталазы, хлорофилл, корриноиды, комплексы металлов с витамином Be, флавином, нуклеозидами, нуклеотидами, полинуклеотидами и нуклеиновыми кислотами. Насколько нам известно, такое детальное рассмотрение строения и функций перечисленных соединений до сих пор нигде не проводилось. [33]
Большинство ферментов находится внутри клетки. KJ точной стенки, например гидролазы целлюлозы и крахмал Эндоферменты чаще всего находятся в клеточных органоидг но могут быть и в цитоплазме, например ферменты, катализ рующие процесс брожения - фосфогексоизомераза, фосфогекс киназа, альдолаза, ферменты пентозного цикла, гидролити1 ские ферменты и др. Гидролитические ферменты, наприм протеазы ( катепсины), липазы, фосфатазы, нуклеазы, уча вующие в процессе автолиза клетки, локализированы в cnei альных органеллах - лизосомах. Полагают, что в бактери функцию лизосом несут мезосомы. [34]
Для этого проводят in vivo трансдукцию или трансфекцию опухолевых клеток геном HSVtk, находящимся под контролем активного промотора, а через несколько дней вводят ганцикловир. Вирусная тимидинки-наза фосфорилирует ганцикловир с образованием ганцикловирмонофосфата. Киназы клетки-хозяина почти не фосфорилируют ганцикловир, зато охотно присоединяют фосфатные группы к его монофосфату с образованием ганцикловир-трифосфата, который ингибирует ДНК-поли-меразу и останавливает синтез ДНК, вызывая гибель пролиферирующих клеток. Кроме того, через межклеточные контакты ганцикловиртри-фосфат может проникать в нетрансфицирован-ные опухолевые клетки, приводя и к их гибели. Одна экспрессирующая ген HSVtk опухолевая клетка может уничтожить до 10 немодифицированных клеток. [35]
АТР; их называют низкоэнергетическими соединениями. Под действием специфичных киназ фосфатные группы от сверхвысокоэнергетических фосфатов, образующихся в процессе катаболизма, могут переноситься на ADP, в результате чего синтезируется АТР. Другие специфичные киназы катализируют перенос концевой фосфатной группы АТР на молекулы-акцепторы, которые превращаются при этом в фосфо-рилированные ( низкоэнергетические) соединения и оказываются благодаря этому активированными; в таком виде они могут вступать в реакции биосинтеза. Следовательно, АТР в процессе метаболизма играет роль универсального промежуточного продукта-переносчика фосфатных групп. АТР также поставляет энергию для функционирования сократительных актиновых и миозиновых нитей скелетных мышц. За счет этой энергии осуществляется скольжение нитей друг относительно друга и как результат этого-сокращение мышцы; при этом АТР гидролизуется до ADP и фосфата. Креа-тинфосфат служит резервуаром высокоэнергетических фосфатных групп в мышечных и нервных клетках. Под действием креатинкиназы он может передавать свои фосфатные группы молекулам ADP. Химическую энергию для мембранных АТРаз тоже поставляет АТР; это дает им возможность переносить ионы Н и некоторые другие катионы через мембраны против градиента концентрации. [36]
Некоторые аналоги природных дезоксинуклеозид-5 - трифосфатов могут также служить субстратами и включаться в полимерный продукт. Специфичность замещения находится в соответствии с правилом образования пар оснований в двойной спирали дезоксирибонуклеиновых кислот, предложенной Уотсоном и Криком. Существенно, что киназы, осуществляющие фосфорилиро-вание дезоксиуридин-5 - фосфата до трифосфата, как оказалось, отсутствуют в Escherichia coli. В обычном смысле реакция полимеризации практически необратима, что находится в соответствии с метаболической стабильностью ДНК. [37]
Приведенные выше характеристики ферментов биосинтеза ТМФ в полной мере относятся и к киназам, фосфорилирующим его до трифосфата. Так, например, отмечено, что экстракт нормальной печени крысы почти не фосфорилирует ТМФ, хотя остальные дезоксимононуклеотиды фосфорилируются нормально. Установлено, что киназы, катализирующие биосинтез ТТФ из тимидина или его монофосфата, отсутствуют в нормальной, но появляются в регенерирующей печени крысы и в других тканях, характеризующихся быстрой скоростью роста. К этому моменту в регенерирующей печени сильно увеличивается активность ДНК-полимеразы - фермента заключительного этапа синтеза ДНК. [38]
В результате фермент переходит в каталитически неактивную фосфо-рилазу 6, которая представляет собой димер. Таким образом, в отсутствие специальных сигналов о необходимости включения фермента в работу он находится в неактивной форме. Введение остатков фосфорной кислоты осуществляется с помощью специальной протеинкиназы - киназы фосфорилазы. Таким образом, превращение фосфорилазы в каталитически активный фермент требует расходования молекул АТФ, которое не учитывалось при оценке биоэнергетического баланса сжигания гликогена. Однако такое пренебрежение расходованием АТФ на регуляцию фосфоролиза вполне оправдано. [39]
Нуклеокапсид образуется внутри клетки, перемещается затем к плазматической мембране и выходит наружу, одетый в оболочку из этой мембраны. Опухолевый рост клеток обусловлен экспрессией вирусного гена src. Этот ген кодирует белок, который, по-видимому, представляет собой киназу, фосфорилирующую белки. Можно думать, что эта киназа участвует в преобразовании дифференцированной клетки в клетку эмбрионального типа. [40]
Обычно активные центры ферментов включают части всех структурных доменов глобулярного белка. Субстраты и кофакторы обычно присоединяются к разным доменам. Кроме того, этот домен обнаружен на N-конце трех дегидрогеназ и одной киназы [230- 233, 235], а также на С-концевой половине четвертой дегидрогена-зы [234] и в средней части фосфорилазы [236], что указывает на возможность дупликации соответствующего гена и его переноса в другое место генома. [41]
В, которую получают связыванием № - ( 6-аминогексил) - 5 - АМР на сефарозе 4В бромщиановым методом. Этот сорбент дает возможность проводить группоспецифическое разделение ферментов, связывающих кофакторы с общей аденилатной частью в виде 5 - АМР. К таким ферментам относятся дегидрогеназы с кофактором NADH, а также некоторые - киназы с кофактором АТР. Концентрация связанного 5 - АМР составляет - 2 мкмоля в 1 мл набухшего геля. Для кристаллической лактатдегидрогеназы связывающая емкость равна - 10 мг фермента на 1 мл набухшего геля в 0 1 М фосфатном буферном растворе ( рН 7) при 20 С. Гель поставляется в виде лиофильно высушенного порошка в пакетах по 5 г, что эквивалентно 20 мл набухшего геля. Порошок содержит добавки для сохранения способности геля к набуханию. [42]
Гормоны глюкагон ( в печени) и адреналин стимулируют аденилатциклазу. В результате в цитозоле увеличивается концентрация цАМФ; цАМФ активирует протеинки-назу. Протеинкиназа фосфорилирует за счет АТФ белки-ферменты, в частности второй фермент из класса протеинкиназ - киназу фос-форилазы. Киназа фосфорилазы из неактивной дефосфорилирован-ной формы переходит в активную фосфорилированную. Активная киназа фосфорилазы за счет АТФ переводит фосфорилазу Ь ( неактивная) в фосфорилазу а, которая катализирует фосфоролитическое расщепление гликогена. Параллельно Протеинкиназа фосфорилирует гликогенсинтазу I, переводя ее в неактивную гликогенсинтазу D, т.е. тормозится синтез гликогена. Каскадный механизм позволяет 1 молекуле гормона привести к образованию 107 - 108 молекул глюкозы. [43]
Все эти замещения специфичны - каждый аналог может замещать лишь соответствующее основание. По-видимому, из-за того, что отсутствие аминогруппы во 2 - м положении позволяет установить с цитозином лишь две водородные связи вместо обычных трех, образующихся при наличии гуанина, замещение дезоксигуанина дезоксиинозином наименее эффективно. Из пяти заместителей, упомянутых выше, лишь два бромпроизводных могут включаться при введении их в виде мо нофосфатов, поскольку фермент киназа может фосфо-рилировать и превратить в трифосфаты только эти два соединения. Эти синтетические аналоги оказываются полезными при выяснении ряда специальных вопросов, связанных со свойствами ДНК - Например, установлено, что при репликации дАТ гуанин не включается в цепочку этого полимера, но если в качестве затравки использовать полимер дАБУ ( БУ обозначает 5-бромурацил), являющийся аналогом полимера дАТ, то включение гуанина происходит. Изучение частоты ближайших соседей ( подробно этот метод изложен в следующем разделе) показывает, однако, что включение гуанина нельзя объяснить простым ошибочным спариванием гуанина с бром-урацилом. В отличие от ДНК температурные переходы в полимере дАТ обратимы. Медленное охлаждение предварительно нагретой смеси двухцепочечных полимеров дАТ и дАБУ позволяет получить гибридные двойные спирали дАТ: дАБУ, имеющие промежуточную температуру плавления и плотность. [44]
Точно так же 5-бромодезоксиуридинтрифосфат и 5-бромодезокси-цитидинтрифосфат могут включаться в синтезируемую ДНК только вместо трифосфатов тимидина и дезоксицитидина соответственно. Закономерность заключается в том, что искусственный аналог включается в ДНК только в случае, если он может образовать водородные связи в спиральной молекуле с партнером того основания, которое он замещает. Следовательно, отсутствие урацила в природных ДНК, по-видимому, объясняется отсутствием киназы, способной фосфорилироватъдезоксиуридин до уровня трифосфатов; вместе с тем широко распространены киназы, фосфорилирующие дезоксирибонуклеозиды ( или их монофосфаты) аденина, гуанина, цитозина и тимина. [45]