Cтраница 3
При этом, однако, разрушается триптофан и образуются побочные продукты. Тиольные группы затем защищают от окисления карбоксиметилированием с помощью иодуксусной кислоты. [31]
Согласно данным, изложенным в главе XII, создается впечатление, что почти каждый ингибитор действует как стимулятор, если он применяется в сравнительно низких концентрациях. Это верно, например, для синильной кислоты, иодуксусной кислоты, двуокиси серы, сероводорода, эфира и уретана. Среди предполагаемых стимуляторов фотосинтеза, которые неизвестны в качестве ингибиторов, мы можем упомянуть ацетальдегид. Сабаличка и Вейдлинг [122] нашли, что скорость выделения кислорода у Elodea удваивается при 0 001 - 0 128 / 0 альдегида. [32]
Специфическое ингибирование отдельных ферментативных реакций, что приводит к накоплению продукта предыдущей ферментативной реакции. В качестве ингибиторов были широко использованы фторид, натрия и иодуксусная кислота. [33]
Из побочных реакций опасность представляет только неконтролируемое окисление цистеина. Чтобы предотвратить его, перед гидролизом проводят карбоксилирование остатков цистеина по сере иодуксусной кислотой или иодацетамидом. Для этого 100 мкг белка растворяют в 0 2 мл 0 5 М Трис-HCl ( рН 8 5), содержащего 6 М гу-анидинхлорида, 8 мМ 3-меркаптоэтанола и 0 25 М ЭДТА, и перемешивают в течение часа микромагнитом под струей сухого азота. За это время происходят денатурация белка, восстановление цистина до цистеинов и удаление кислорода. Затем добавляют 10 мкл свежеприготовленного 0 3 % - ного водного раствора иодуксусной кислоты. Карбоксиметилирование идет в течение 20 мин в темноте. Избыток иодуксусной кислоты нейтрализуют добавлением 10 мкл 3-меркапто-этанола, после чего нрепарат диализуют против МН4 - бикарбонатного буфера и лиофилизируют. [34]
Хотя обычно диеновый синтез легко протекает в мягких условиях, интересно рассмотреть ВОЗМОЖНОСТЕ повышения скоростей реакций в наименее активных системах под влиянием катализатора. Так, было показано, что система циклопентадиен - и-бензохинон лишь слабо реагирует на присутствие толуолсульфоновой или иодуксусной кислоты, пиридина, иода или кислорода. [35]
Хотя обычно диеновый синтез легко протекает в мягких условиях, интересно рассмотреть возможность повышения скоростей реакций в наименее активных системах иод влиянием катализатора. Так, было показано, что система циклопентадиен - ге-бензохинон лишь слабо реагирует на присутствие толуолсульфоновой или иодуксусной кислоты, пиридина, иода или кислорода. [36]
Таким же путем вносили 10 мкл свежеприготовленного раствора иодуксусной кислоты ( 29 мг в 10 мл воды) и вели кар-боксиметилирование остатков цистеина в течение 20 мин в темноте. [37]
Иод -, бром - и хлорацетаты натрия легко взаимодействуют с сульфгидрильными, аминными, имидазольными группами полимерного субстрата с образованием соответствующих карбок-симетильных производных. Так, S-карбоксиметилирование белков в растворе иодуксусной кислоты происходит очень быстро и специфично. Реакции алкилирования йодистым метилом или дибромэтиленом протекают медленнее, нежели с иодуксусной кислотой, и реализуются преимущественно на - SH - и NH2 - группах белка. В некоторых случаях возможен также деструктивный распад полимерной цепи. [38]
Цистеиновые протеиназы [65] очень сходны с сериновыми. Объектом большинства работ служил папаин. Папаин состоит из одной полипептидной цепи почти того же размера ( 212 остатков), что и у химотрипсина, с характерной глубокой впадиной, содержащей участок связывания субстрата. Папаин инактивируется иодуксусной кислотой, которая, как известно, ал-килирует тиоловые группы. Так как шесть из семи остатков цис-теина фермента связаны в дисульфидные мостики, в реакции принимает участие единственная свободная HS-группа цистеина-25. Имеется убедительное доказательство образования ацилфермент-ного интермедиата: как и в случае химотрипсина, можно приготовить циннамоилпапаин. [39]
Интересно отметить, что для поддержания большой скорости потребления глюкозы требуется очень низкий уровень обменивающегося фосфата. Так как при анаэробных условиях фосфорилирование связано с окислением только на двух стадиях в цикле, можно было придумать эксперимент, позволявший определить, на какой стадии происходит разрыв процессов фосфорили-рования и окисления. Такое независимое течение процессов должно было бы объяснить низкую потребность в неорганическом фосфате, поскольку организм эффективно выключает одну или обе реакции в цикле, через которые меченый фосфат должен внедряться при установлении обратимого равновесия фосфорили-рования, а именно, на стадии окисления триозы или начального фосфорюшрования глюкозы. В присутствии азида клетки были нечувствительны к иодуксусной кислоте, взятой в концентрациях нормально полностью тормозящих брожение ( иодуксусная кислота является специфическим парализатором энзима окисления триозы), и поэтому очевидно, что разрыв этих процессов имел место на стадии окисления триозы. [40]
Установление первичной структуры начинается с определения аминокислотного состава и молекулярной массы выделенного и очищенного белка. Белки, состоящие из нескольких полипептидных цепей, разделяются с помощью денатурирующих реагентов ( концентрированный раствор мочевины или ДСН) на мономеры. Дисульфидные мостики расщепляют восстановлением меркаптоэтанолом. Для предотвращения дисульфидного обмена и окисления образующихся свободных меркаптогрупп их блокируют каким-либо методом, например алкилированием иодуксусной кислотой с образованием S-карбоксиметильного производного или цианэтилированием акри-лонитрилом. После определения N - и С-концевых аминокислот полипептидная цепь расщепляется химически или ферментативно ( в нескольких вариантах) на меньшие перекрывающиеся фрагменты. Для каждого фрагмента устанавливается аминокислотная последовательность. И наконец, комбинируя отдельные последовательности, приходят к полной последовательности исходной полипептидной цепи. [41]
Интересно отметить, что для поддержания большой скорости потребления глюкозы требуется очень низкий уровень обменивающегося фосфата. Так как при анаэробных условиях фосфорилирование связано с окислением только на двух стадиях в цикле, можно было придумать эксперимент, позволявший определить, на какой стадии происходит разрыв процессов фосфорили-рования и окисления. Такое независимое течение процессов должно было бы объяснить низкую потребность в неорганическом фосфате, поскольку организм эффективно выключает одну или обе реакции в цикле, через которые меченый фосфат должен внедряться при установлении обратимого равновесия фосфорили-рования, а именно, на стадии окисления триозы или начального фосфорюшрования глюкозы. В присутствии азида клетки были нечувствительны к иодуксусной кислоте, взятой в концентрациях нормально полностью тормозящих брожение ( иодуксусная кислота является специфическим парализатором энзима окисления триозы), и поэтому очевидно, что разрыв этих процессов имел место на стадии окисления триозы. [42]
Превращение скополамина и скопина в скополин начинается с расщепления цис-эпоксидной группы. Кислородный мостик, вновь образовавшийся в скополине, по пространственным причинам может располагаться только в гране-положении к азотистому мостику. Из этого вытекает, что гидроксильная группа при С3 должна находиться в транс-положении по отношению к атому азота. Оксигруппа при С7 в скополине, в свою очередь, находится в транс-положении к эфирному кольцу; поэтому при действии на скополин эфиром иодуксусной кислоты получается лактон I, который может образоваться только при цис-располо-жении гидроксила при С7 по отношению к атому азота. [43]
ТОЗИЛ-L фенилаль-тон), специфически реагирующий с одним из имя-колец ( остаток гистидина) в ферменте а-химотрипсине ( разд. Эти соединения значительно более реакционноспо-собны при 5 2-замещениях, чем галогеналкилы. Следует ожидать, что отрицательный индуктивный эффект карбонильной группы повышает электрофильность метилеповой группы и стабилизирует приближающийся нуклеофил анионной природы. Галогенкислоты и их амиды проявляют эффект, так что и иодуксусная кислота, и иодацетамид применение в качестве реагентов для алкилирования чистых ферментов. [44]
Из побочных реакций опасность представляет только неконтролируемое окисление цистеина. Чтобы предотвратить его, перед гидролизом проводят карбоксилирование остатков цистеина по сере иодуксусной кислотой или иодацетамидом. Для этого 100 мкг белка растворяют в 0 2 мл 0 5 М Трис-HCl ( рН 8 5), содержащего 6 М гу-анидинхлорида, 8 мМ 3-меркаптоэтанола и 0 25 М ЭДТА, и перемешивают в течение часа микромагнитом под струей сухого азота. За это время происходят денатурация белка, восстановление цистина до цистеинов и удаление кислорода. Затем добавляют 10 мкл свежеприготовленного 0 3 % - ного водного раствора иодуксусной кислоты. Карбоксиметилирование идет в течение 20 мин в темноте. Избыток иодуксусной кислоты нейтрализуют добавлением 10 мкл 3-меркапто-этанола, после чего нрепарат диализуют против МН4 - бикарбонатного буфера и лиофилизируют. [45]