Cтраница 4
Из побочных реакций опасность представляет только неконтролируемое окисление цистеина. Чтобы предотвратить его, перед гидролизом проводят карбоксилирование остатков цистеина по сере иодуксусной кислотой или иодацетамидом. Для этого 100 мкг белка растворяют в 0 2 мл 0 5 М Трис-HCl ( рН 8 5), содержащего 6 М гу-анидинхлорида, 8 мМ 3-меркаптоэтанола и 0 25 М ЭДТА, и перемешивают в течение часа микромагнитом под струей сухого азота. За это время происходят денатурация белка, восстановление цистина до цистеинов и удаление кислорода. Затем добавляют 10 мкл свежеприготовленного 0 3 % - ного водного раствора иодуксусной кислоты. Карбоксиметилирование идет в течение 20 мин в темноте. Избыток иодуксусной кислоты нейтрализуют добавлением 10 мкл 3-меркапто-этанола, после чего нрепарат диализуют против МН4 - бикарбонатного буфера и лиофилизируют. [46]
Существует несколько методов, с помощью которых можно обнаружить аминокислотные остатки, ответственные за биологическую активность белков. В первом методе белок необходимо подвергнуть частичной деградации, в особенности вблизи N - и С-кон-цов соответственно с помощью аминопептидаз и карбоксипептидаз. Например, удаление ( с помощью карбоксипептидазы) трех остатков с С-конца рибонуклеазы не влияет на ее активность. Более глубокая деградация в этой части молекулы, однако, приводит к инактивации. По второму методу необходимо подвергнуть химической модификации боковые группы аминокислотных остатков белка. Естественно, что результаты такого рода экспериментов проще интерпретировать в том случае, когда эта модификация специфична. Например, легко идентифицировать область связывания кофермента пиридоксальфосфата в аминотрансферазе. Альд-имин, образующийся в результате конденсации - кофермента с е-аминогруппой остатка лизина, восстанавливают борогидридом натрия и идентифицируют, так как он не затрагивается при гидролитическом распаде. Аналогично, ферменты, содержащие тиоль-ные группы, такие как алкогольдегидрогеназа, 3-фосфоглицераль-дегиддегидрогеназа и папаин, обычно ингибируют реакцией с n - хлормеркурибензойной или иодуксусной кислотой. [47]